第四章分子遗传学相关实验 实验一 利用TSL从全血中直接制备人类染色体 DNA 一、实验目的 初步掌握人类基因组DNA的提取方法。 二、实验原理 在临床实践和医学遗传学研究过程中，为了进行遗传病患者的基因分析 和基因诊断，必须首先从人体组织中（常以外周血为材料）提取基因组DNA 分子。在细胞核中，DNA分子常与蛋白质结合在一起形成脱氧核糖核蛋白， 即基因组DNA是以核蛋白的形式存在于细胞核中，故从组织提取DNA必 须除去与DNA分子结合的蛋白质和其他物质，同时尽可能保持DNA分子 的完整性。 TLS法是近年来出现的一种提取DNA的较好方法。TLS(三乙醇胺月桂 基硫磺酸盐)是一种较强的表面活性剂，它能迅速地溶解细胞质膜和核膜 故TLS能在较短时间内溶解细胞并能使DNA与蛋白质分离而不必经过蛋白 酶的水解，TS法能简化DNA提取的程序，整个过程能在3小时内完成。 三、实验用品 1.器材：台式高速离心机、Eppendorf试管、真空泵、751分光光度计、 连续可调加样器、加样吸头、废液小烧杯、吸球、吸管、蜡膜、电泳仪、紫 外检测仪、移液管等 2.材料：人外周血 3.试剂：1%TLS、饱和酚液、氯仿、无水乙醇、3moM醋酸钠、70% 乙醇、TE液 4.试剂的配制： 1)1 mol/ITris-HC1液：称Tris碱12L91g,溶于800ml双蒸水中，用浓 HC1周至所需PH值(PH7.4、7.6、8.0的HC1分别是70ml、60ml、42ml), 在调PH值时，应使用溶液冷至室温后方可调，最后定容至1000ml分装后， 高压蒸汽灭菌，若呈黄色，应弃
1 第四章 分子遗传学相关实验 实验一 利用 TSL 从全血中直接制备人类染色体 DNA 一、 实验目的 初步掌握人类基因组 DNA 的提取方法。 二、 实验原理 在临床实践和医学遗传学研究过程中，为了进行遗传病患者的基因分析 和基因诊断，必须首先从人体组织中（常以外周血为材料）提取基因组 DNA 分子。在细胞核中，DNA 分子常与蛋白质结合在一起形成脱氧核糖核蛋白， 即基因组 DNA 是以核蛋白的形式存在于细胞核中，故从组织提取 DNA 必 须除去与 DNA 分子结合的蛋白质和其他物质，同时尽可能保持 DNA 分子 的完整性。 TLS 法是近年来出现的一种提取 DNA 的较好方法。TLS（三乙醇胺月桂 基硫磺酸盐）是一种较强的表面活性剂，它能迅速地溶解细胞质膜和核膜， 故TLS能在较短时间内溶解细胞并能使DNA与蛋白质分离而不必经过蛋白 酶的水解，TLS 法能简化 DNA 提取的程序，整个过程能在 3 小时内完成。 三、 实验用品 1．器材：台式高速离心机、Eppendorf 试管、真空泵、751 分光光度计、 连续可调加样器、加样吸头、废液小烧杯、吸球、吸管、蜡膜、电泳仪、紫 外检测仪、移液管等 2． 材料：人外周血 3． 试剂：1%TLS、饱和酚液、氯仿、无水乙醇、3mol/l 醋酸钠、70% 乙醇、TE 液 4． 试剂的配制： 1）1mol/lTris-HCl 液：称 Tris 碱 121.91g，溶于 800ml 双蒸水中，用浓 HCl 调至所需 PH 值（PH7.4、7.6、8.0 的 HCl 分别是 70ml、60ml、42ml）， 在调 PH 值时，应使用溶液冷至室温后方可调，最后定容至 1000ml 分装后， 高压蒸汽灭菌，若呈黄色，应弃
2)0.5 nol/EDTA液：称取冰乙二胺四乙酸二钠(EDTA-N2·2H20) 186.1g,溶于800ml双蒸水中，在磁力搅拌器上均匀，用NaOH调节的PH 至8.0（约需20gNa0H颗粒），然后等定容至1000ml分装后灭菌备用。 3)TE溶液：1 MTris-.LC11ml、0.5 M EDTA0.2ml,加水至100ml。 4)ACD:枸橼酸1.6g柠檬酸钠4.4g,单分子葡萄糖4.9g加水至200ml (然后高压灭菌)。 5)NaAC(3mol/L):NaAC·2HO10.8g,H020ml溶解后用冰乙酸调 至PH5.2,定溶至100ml,高压灭菌。 6)Tris-HC1饱和重蒸酚溶液(PH8.0):取50ml重蒸酚置于65℃会融 化后加入等体积的1 mol/LTris-HC1(PH8.0)缓冲液，充分混匀后置于4C冰 箱中静置6小时以上，待充分分层（酚在下，水在上），吸弃上层多余的水 相，冰箱保存备用。 7)加样缓冲液：溴酚蓝0.25g溶于70ml水中，加30ml甘油混匀，4℃ 保存。 8)溴乙锭(10mg/ml):称取100mg溴乙锭溶于10ml水中，4℃保存。 (每100ml1×TBE凝胶中加5ul,终浓度为0.5μgml)。 9)5×TBE电泳缓冲液：Tris54g,跚酸27.5g,0.5 M EDTA(PH8.0)20ml 加双蒸水至100ml。 10)1%琼脂糖凝胶：琼脂糖1g,5×TBE20ml加双蒸水至100ml, 加热溶解，温度降至55℃时，加溴乙锭。 四、实验内容与步骤 1.取人外周血1ml加到含有0.1 mlACD的离心管中，加5倍体积蒸 馏水，在0℃下放置10分钟。 2.8000pm离心10分钟，弃上清，留管底白细胞沉淀物。 3.加300ul1%TLS,轻轻混匀，50℃或室温下放置20分钟。 4.加1ml饱和酚轻轻充分混匀，呈乳白色。 5.10000pm离心5-10分钟。 6,取上清（管中液体分三层：上清液中含有DNA,中层白色物质为 蛋白质，底层为酚)加入另一新管中，再加饱和酚（等体积）抽提12次， 万法同4、5。 7.取上清，加24：1（氯仿、异丙醇）1m两次，方法同4、5。 8.取上清加入到1.5 ml Eppendorf管中，再加80μl,3 mol/LNaAC (pH5.2)混匀。 9.加Iml冷无水乙醇缓慢混匀，可见DNA纤维沉淀成DNA小块， 12000rpm离心10分钟 10.弃上清，管口敞开，使乙醇挥发干净，或真空抽干去醇
2 2）0.5mol/lEDTA 液：称取冰乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2·2H2O） 186.1g，溶于 800ml 双蒸水中，在磁力搅拌器上均匀，用 NaOH 调节的 PH 至 8.0（约需 20g NaOH 颗粒），然后等定容至 1000ml 分装后灭菌备用。 3)TE 溶液：.1MTris-LCl 1ml、0.5M EDTA 0.2ml，加水至 100ml。 4）ACD：枸橼酸 1.6g 柠檬酸钠 4.4g，单分子葡萄糖 4.9g 加水至 200ml （然后高压灭菌）。 5）NaAC（3mol/L）：NaAC·2H2O10.8g，H2O20ml 溶解后用冰乙酸调 至 PH5.2，定溶至 100ml，高压灭菌。 6）Tris-HCl 饱和重蒸酚溶液（PH8.0）：取 50ml 重蒸酚置于 65℃会融 化后加入等体积的 1mol/LTris-HCl（PH8.0）缓冲液，充分混匀后置于 4℃冰 箱中静置 6 小时以上，待充分分层（酚在下，水在上），吸弃上层多余的水 相，冰箱保存备用。 7）加样缓冲液：溴酚蓝 0.25g 溶于 70ml 水中，加 30ml 甘油混匀，4℃ 保存。 8）溴乙锭（10mg/ml）：称取 100mg 溴乙锭溶于 10ml 水中，4℃保存。 （每 100ml 1×TBE 凝胶中加 5μl，终浓度为 0.5μg/ml）。 9）5×TBE 电泳缓冲液：Tris 54g，硼酸 27.5g，0.5M EDTA(PH8.0)20ml 加双蒸水至 100ml。 10）1%琼脂糖凝胶：琼脂糖 1g，5×TBE 20ml 加双蒸水至 100ml， 加热溶解，温度降至 55℃时，加溴乙锭。 四、 实验内容与步骤 1． 取人外周血 1ml 加到含有 0.1mlACD 的离心管中，加 5 倍体积蒸 馏水，在 0℃下放置 10 分钟。 2． 8000rpm 离心 10 分钟，弃上清，留管底白细胞沉淀物。 3． 加 300μl 1%TLS,轻轻混匀，50℃或室温下放置 20 分钟。 4． 加 1ml 饱和酚轻轻充分混匀，呈乳白色。 5． 10000rpm 离心 5-10 分钟。 6． 取上清（管中液体分三层：上清液中含有 DNA，中层白色物质为 蛋白质，底层为酚）加入另一新管中，再加饱和酚（等体积）抽提 1-2 次， 方法同 4、5。 7． 取上清，加 24：1（氯仿、异丙醇）1ml 两次，方法同 4、5。 8． 取上清加入到 1.5ml Eppendorf 管中，再加 80μl，3mol/L NaAC （pH5.2）混匀。 9． 加 1ml 冷无水乙醇缓慢混匀，可见 DNA 纤维沉淀成 DNA 小块， 12000rpm 离心 10 分钟 10．弃上清，管口敞开，使乙醇挥发干净，或真空抽干去醇
11.加40如lTE溶液，溶解DNA2-3天，可用于电泳，（亦可用蜡膜封 口，4℃保存)。 12.取2l的加样缓冲液于蜡膜上，再加入10uDNA溶液，混匀。 13.80V预电泳20分钟，然后将以上混合液注入凝胶板的样品孔内， 电泳约1小时。 14.在紫外灯下观察电泳结果。 五、作业与思考 1.本实验中的注意事项有哪些 2.实验原理的要点是什么？ (赵静)
3 11．加 40μl TE 溶液，溶解 DNA2-3 天，可用于电泳，（亦可用蜡膜封 口，4℃保存）。 12．取 2μl 的加样缓冲液于蜡膜上，再加入 10μlDNA 溶液，混匀。 13．80V 预电泳 20 分钟，然后将以上混合液注入凝胶板的样品孔内， 电泳约 1 小时。 14． 在紫外灯下观察电泳结果。 五、 作业与思考 1． 本实验中的注意事项有哪些？ 2． 实验原理的要点是什么？ （赵静）
实验二 外周血基因组DNA的提取 一、实验目的 掌握人外周血基因组DNA的抽提方法。 二、实验原理 从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的DNA是进行基因诊断的先决 条件。制备高质量DNA的原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干 净，②尽可能保持DNA分子的完整。 三、实验用品 离心管、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱。 四、实验内容与方法 (一)方法一 1.加900ul细胞裂解液与一个消毒的1.5ml离心管中。 2.抽取外周血（防凝），轻摇，使血液完全混匀，然后将300如l血液 转移到盛有细胞裂解液的离心管内，颠倒5-6次混匀。 3.室温放置10分钟（其间颠倒2~3次）以裂解红细胞，以13000-16000 pm室温下离心20秒。 4.尽可能地移弃上清液，约留10-20如l沉淀在管底。 注：如果一些红细胞或碎片摻杂在白细胞中，可以加等量细胞裂解 液重复3-4。 5.剧烈混匀（用振荡器震荡，或用移液器吹起），至白细胞重新悬起。 6.加入300u核裂解液，混匀5-6次以助分散DNA。溶液应很粘。如 细胞仍呈块状，37℃水浴至细胞块碎裂。如1小时后仍呈块状，加100u核 裂解液重复水浴。 7.可选。加1.5μIRNase液于核溶解产物中，混匀2-5次，将混匀物37℃ 水浴15分钟，然后冷至室温。 8.加100d蛋白沉淀液，刷烈摇晃10-20秒，小的蛋白质块应能看到。 9.13000-16000pm离心3分钟，室温，暗褐色的蛋白质沉淀应能看到。 10.上清液移到含300ul室温异丙醇的1.5ml离心管中。 11.轻轻颠倒离心管，可看到絮状沉淀。 12.13000-16000rpm离心1分钟，室温DNA成沉淀状。 13.轻轻倒出上清，加入300u室温70%乙醇，轻轻颠倒离心管，离心 沉淀比较松散，将管子轻轻倒置在洁净的吸水纸上，空气干燥DNA10-15 分钟。 14.用最小的吸头抽吸去乙醇（一定要避免抽取DNA沉淀，因为此时 DNA沉淀比较松散，将管子轻轻倒置在洁净的吸水纸上，空气干燥DNA
4 实验二 外周血基因组 DNA 的提取 一、 实验目的 掌握人外周血基因组 DNA 的抽提方法。 二、 实验原理 从不同组织细胞或血细胞中提取高质量的 DNA 是进行基因诊断的先决 条件。制备高质量 DNA 的原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干 净，②尽可能保持 DNA 分子的完整。 三、实验用品 离心管、吸管、加样器、枪头、离心机、水浴箱。 四、实验内容与方法 （一）方法一 1．加 900μl 细胞裂解液与一个消毒的 1.5ml 离心管中。 2．抽取外周血（防凝），轻摇，使血液完全混匀，然后将 300μl 血液 转移到盛有细胞裂解液的离心管内，颠倒 5-6 次混匀。 3．室温放置 10 分钟（其间颠倒 2~3 次）以裂解红细胞，以 13000-16000 rpm 室温下离心 20 秒。 4．尽可能地移弃上清液，约留 10-20μl 沉淀在管底。 注：如果一些红细胞或碎片掺杂在白细胞中，可以加等量细胞裂解 液重复 3-4。 5．剧烈混匀（用振荡器震荡，或用移液器吹起），至白细胞重新悬起。 6．加入 300μl 核裂解液，混匀 5-6 次以助分散 DNA。溶液应很粘。如 细胞仍呈块状，37℃水浴至细胞块碎裂。如 1 小时后仍呈块状，加 100μl 核 裂解液重复水浴。 7．可选。加 1.5μlRNase 液于核溶解产物中，混匀 2-5 次，将混匀物 37℃ 水浴 15 分钟，然后冷至室温。 8．加 100μl 蛋白沉淀液，剧烈摇晃 10-20 秒，小的蛋白质块应能看到。 9．13000-16000 rpm 离心 3 分钟，室温，暗褐色的蛋白质沉淀应能看到。 10．上清液移到含 300μl 室温异丙醇的 1.5ml 离心管中。 11．轻轻颠倒离心管，可看到絮状沉淀。 12．13000-16000 rpm 离心 1 分钟，室温 DNA 成沉淀状。 13．轻轻倒出上清，加入 300μl 室温 70%乙醇，轻轻颠倒离心管，离心 沉淀比较松散，将管子轻轻倒置在洁净的吸水纸上，空气干燥 DNA 10-15 分钟。 14．用最小的吸头抽吸去乙醇（一定要避免抽取 DNA 沉淀，因为此时 DNA 沉淀比较松散，将管子轻轻倒置在洁净的吸水纸上，空气干燥 DNA
10-15分钟) 15.加入100uDNA水化溶剂，65度1小时，其间不断敲击管子以助 均匀或者室温或4度过夜即可。 16.2-8度保存。 注：采血需用EDTA或肝素抗凝。 (二)方法二 以处理100ul全血为例。 1.按处理样品数准备1.5ml离心管，并各加入GenTLESolutionI500l。 2.把混合均匀的l00ul血液，加入到分装好GenTLE Solution I的离心管 中，立即振荡数秒钟*1。 1不管处理多少样品，血液加入到GenTLE Solutionl中，要立即 进行振荡混合，否则有可能降低收量。 3.室温放置10分钟以上，然后在室温2条件下12,000rpm以上离心5 分钟。离心时，请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一，离心管的小耳 朵朝上（图4-I)。此时几乎看不到DNA沉淀。 2若离心温度低，会对收量和纯度有影响，请于20℃以上离心。 4.用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管外侧（带 小耳朵一侧)的内壁上，除去溶液时，请一定注意枪头不要碰到离心管外侧 的内壁，应插到离心管内侧的底部（图4-2），注意不要吸走沉淀物。 5.加入lml的GenTLE SolutionⅡ，此时GenTLE SolutionⅡ应沿着离心 管内侧的内壁加入到离心管中（图43）。 图4-1 图4-2 图4-3 6.轻柔地上下颠倒离心管数次*3，室温12,000rpm以上离心2分钟，用 移液枪小心地除去上清溶液（方法参见实验操作4.）。 3剧烈振荡将影响收量和纯度。 7.向离心管中加入GenTLE Solution III500ul,轻微振荡10秒钟充分混 合。 8.室温12,000pm以上离心5分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管 中。 9.加入等体积(500u)的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，均匀混合
5 图 4-1 图 4-2 图 4-3 10-15 分钟） 15．加入 100μlDNA 水化溶剂，65 度 1 小时，其间不断敲击管子以助 均匀或者室温或 4 度过夜即可。 16．2-8 度保存。 注：采血需用 EDTA 或肝素抗凝。 （二）方法二 以处理 100μl 全血为例。 1.按处理样品数准备 1.5ml 离心管，并各加入 GenTLESolutionI 500μl。 2.把混合均匀的 100μl 血液，加入到分装好 GenTLE Solution I 的离心管 中，立即振荡数秒钟*1。 *1 不管处理多少样品，血液加入到 GenTLE SolutionI 中，要立即 进行振荡混合, 否则有可能降低收量。 3.室温放置 10 分钟以上，然后在室温*2 条件下 12,000 rpm 以上离心 5 分钟。离心时，请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一，离心管的小耳 朵朝上（图 4-1)。此时几乎看不到 DNA 沉淀。 *2 若离心温度低，会对收量和纯度有影响，请于 20℃以上离心。 4.用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管外侧（带 小耳朵一侧）的内壁上，除去溶液时，请一定注意枪头不要碰到离心管外侧 的内壁，应插到离心管内侧的底部（图 4-2)，注意不要吸走沉淀物。 5.加入 1 ml 的 GenTLE Solution II。此时 GenTLE Solution II 应沿着离心 管内侧的内壁加入到离心管中（图 4-3)。 6.轻柔地上下颠倒离心管数次*3，室温 12,000 rpm 以上离心 2 分钟，用 移液枪小心地除去上清溶液（方法参见实验操作 4.)。 *3 剧烈振荡将影响收量和纯度。 7.向离心管中加入 GenTLE Solution III 500μl，轻微振荡 10 秒钟充分混 合。 8.室温 12,000rpm 以上离心 5 分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管 中。 9.加入等体积（500μl）的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，均匀混合