实验4微生物分离与纯化技术一、目的了解学习分离、纯化技术的概念。学习掌握划线和稀释分离微生物技术。二、原理分离就是把成群的菌体一个一个地分开：纯化就是进一步分离，把菌种绝底分成单个菌体的技术。要想从含有多种多样、多姿多态微生物的自然界中获得我们所需的菌（菌株），就要通过各种手段方法把一个一个微生物分离开，然后从中挑选出我们所需要的菌株应用于研究或生产之中。分离技术有许多种，下面着重介绍从土壤中通过划线法分离细菌、放线菌、霉菌的技术。三、材料、试剂与器具1.材料牛肉膏蛋白陈平板、高氏1号平板（含1%酚液5~6滴/L），土豆蔗糖平板（含80%红酸1mL/L）各二套，土壤样品一份，无菌水一瓶。2．器具接种环，酒精灯，超净工作台等用具。四、操作步骤1、取土壤少许，加入一定量的无菌水，制土壤菌悬液。2、划线分离（在接种室或超净工作台内进行）（1）直线划线法：左手拿平板平皿，盖稍微打开，右手拿接种环，以无菌操作蘸一环土壤菌悬液，在平板一边划第一道平行线2~3条，转动培养皿约70度角，用烧灼过的接种环，待冷却后，接种环从第一道线划过做第二道平行线，同法划第三道平行线，如此划第四道平行线（如图4-1)。每种培养基划线一套。niensteSrgecok图4-121
21 实验 4 微生物分离与纯化技术 一、目的 了解学习分离、纯化技术的概念。 学习掌握划线和稀释分离微生物技术。 二、原理 分离就是把成群的菌体一个一个地分开；纯化就是进一步分离，把菌种绝底分成单 个菌体的技术。 要想从含有多种多样、多姿多态微生物的自然界中获得我们所需的菌（菌株），就 要通过各种手段方法把一个一个微生物分离开，然后从中挑选出我们所需要的菌株应用 于研究或生产之中。分离技术有许多种，下面着重介绍从土壤中通过划线法分离细菌、放 线菌、霉菌的技术。 三、材料、试剂与器具 1．材料 牛肉膏蛋白胨平板、高氏 1 号平板（含 1%酚液 5~6 滴/L），土豆蔗糖平 板（含 80%红酸 1mL/L）各二套，土壤样品一份，无菌水一瓶。 2．器具 接种环，酒精灯，超净工作台等用具。 四、操作步骤 1、取土壤少许，加入一定量的无菌水，制土壤菌悬液。 2、划线分离（在接种室或超净工作台内进行） （1）直线划线法：左手拿平板平皿，盖稍微打开，右手拿接种环，以无菌操作蘸一 环土壤菌悬液，在平板一边划第一道平行线 2~3 条，转动培养皿约 70 度角，用烧灼过的 接种环，待冷却后，接种环从第一道线划过做第二道平行线，同法划第三道平行线，如此 划第四道平行线（如图 4- 1）。每种培养基划线一套。 图 4-1
（2）曲线划线法：其它操作如同直线法，只是划线是划成曲线（如图4-2）。每种培养基划线一套。D图4-2平板接种与划线法A.接种时，用左手将平血开启一缝：B.棉签伸手入平板接种：C.用已灭菌并冷却了的接种环划线：D.第二部分划线：E最后部分划线（3）划线完后，把平皿倒置放在30℃下培养，细菌分离要培养24~48h：放线菌分离要培养5~7d；霉菌分离要培养3~5d。观察生长的菌落（图4-3），再作进一步的分离纯化或直接挑取单个菌落接入斜面培养后保存备用。图4-3划线分离出的细菌单菌落22
22 （2）曲线划线法：其它操作如同直线法，只是划线是划成曲线（如图 4-2）。每种 培养基划线一套。 （3）划线完后，把平皿倒置放在 30℃下培养，细菌分离要培养 24~48h，放线菌分 离要培养 5~7d；霉菌分离要培养 3~5d。观察生长的菌落（图 4-3），再作进一步的分离纯 化或直接挑取单个菌落接入斜面培养后保存备用。 图 4-3 划线分离出的细菌单菌落 图 4-2 平板接种与划线法 A.接种时，用左手将平皿开启一缝；B.棉签伸手入平板接种； C．用已灭菌并冷却了的接种环划线；D.第二部分划线；E.最后部分划线
五、注意事项1、分离纯化操作全过程要在无菌室或超净工作台内进行。2、划线时时，接种环要圆滑；接种环与平板成45°角，用手腕力轻巧地在平面上滑动，避免划破培养基：防止在空间划线。六、实验报告1、记录好平板划线，并自作评价。2、比较细菌、放线菌、霉菌分离菌落的不同。七、思考题1、划线分离过程中，划完第一道线后再划第二道线时，为什么接种环要在火焰上烧灼冷却后再划线呢？2、试设计从水果（如葡萄或雪梨）中分离酵母菌的实验。23
23 五、注意事项 1、分离纯化操作全过程要在无菌室或超净工作台内进行。 2、划线时时，接种环要圆滑；接种环与平板成 45°角，用手腕力轻巧地在平面上 滑动，避免划破培养基；防止在空间划线。 六、实验报告 1、记录好平板划线，并自作评价。 2、比较细菌、放线菌、霉菌分离菌落的不同。 七、思考题 1、划线分离过程中，划完第一道线后再划第二道线时，为什么接种环要在火焰上烧 灼冷却后再划线呢？ 2、试设计从水果（如葡萄或雪梨）中分离酵母菌的实验
实验5圆褐固氮菌的分离、纯化与测定一、目的学习和掌握从土壤中分离纯化和鉴定圆褐固氮菌。二、原理土壤是微生物的大本营，有多种多样的各类微生物，许多有实用价值的菌种是从土壤中分离出来的，如能自生固氮的圆褐固氮菌。圆褐固氮菌菌体为球形，常常呈“8”字形，具有荚膜、产生褐色的粘稠液和固氮特性。肥活的土壤中自生固氮菌数量很多，许多农作物的根际也富含自生固氮菌。这些固氮菌体中含有固氮酶，能固定空气中的无机氮（N2）转化为氨（NH），提供植物所需要的氮源物质。我们可以利用自生固氮菌在阿须贝（Ashby）无氮琼脂培养基上生长，而其它菌不能生长的这一特性，从土壤中分离纯化出高固氮活性的圆褐固氮菌应用于科研或生产。固氮酶能把N2转化为NH3，同时也能把CH2还原为C2H4，利用这一特性可以在气相色谱仪上测定固氮酶活性高低。（图5-1）气相色谱记录图空气，10%CH（好氧物）CH或10%CH，inN，或Ar（厌氧物）时间。定时取瓶子上CH部分的样品，培养并进行气相色CH谱分析2H1hHCECH+H,CCH乙炔乙烯CH含有细胞悬液，固氨醇塞住瓶口CH2h图5-1乙炔还原法测定固氮酶活性。实验开始时（时间为0）结果显示无C2H4存在，但随着实验检测过程的继续，C2H4产物增加。注意C2H2如何增加的过程。如果瓶中含有酶的提取物，条件应该是厌氧，即使固氮酶来源于好氧细菌，也是如此。三、材料、试剂与器具1.材料各种土壤样品，阿须贝无氮琼脂平板培养基数套。2.试剂乙炔。3.器具接种工具，超净工作台，血清瓶，气相色谱仪等。24
24 实验 5 圆褐固氮菌的分离、纯化与测定 一、目的 学习和掌握从土壤中分离纯化和鉴定圆褐固氮菌。 二、原理 土壤是微生物的大本营，有多种多样的各类微生物，许多有实用价值的菌种是从土 壤中分离出来的，如能自生固氮的圆褐固氮菌。圆褐固氮菌菌体为球形，常常呈“8”字 形，具有荚膜、产生褐色的粘稠液和固氮特性。 肥活的土壤中自生固氮菌数量很多，许多农作物的根际也富含自生固氮菌。这些固 氮菌体中含有固氮酶，能固定空气中的无机氮（N2）转化为氨（NH + 4 ），提供植物所需要 的氮源物质。我们可以利用自生固氮菌在阿须贝（Ashby）无氮琼脂培养基上生长，而其 它菌不能生长的这一特性，从土壤中分离纯化出高固氮活性的圆褐固氮菌应用于科研或 生产。 固氮酶能把 N2 转化为 NH3，同时也能把 C2H2 还原为 C2H4，利用这一特性可以在 气相色谱仪上测定固氮酶活性高低。（图 5-1） 三、材料、试剂与器具 1． 材料 各种土壤样品，阿须贝无氮琼脂平板培养基数套。 2． 试剂 乙炔。 3．器具 接种工具，超净工作台，血清瓶，气相色谱仪等。 图 5-1 乙炔还原法测定固氮酶活性。实验开始时（时间为 0）结果显示无 C2H4 存在，但随着实验 检测过程的继续，C2H4 产物增加。注意 C2H2 如何增加的过程。如果瓶中含有酶的提取物，条件 应该是厌氧，即使固氮酶来源于好氧细菌，也是如此
四、操作步骤1、取样用干净的铲子在表土下5cm~10cm之间，取少量土壤样品，放入干净的平皿中或信封内。各种类型的土壤各取一份。2、增殖培养用于净的镊子取绿豆大小土壤，排放在无氮平板上，每种土壤样品排放一个平板。置28℃~30℃下培养5~7d，观察土粒周围是否有褐色的粘稠液产生，若有则进入下一步工作。3、分离采取平板划线分离，观察是否有褐色粘稠液的单个菌落。4、镜检取单个菌落材料制水片或干片后在显微镜下观察检查，菌体是否都为8”字形或球形菌体，如果是则此菌落是纯菌落，若含有其它形态如短杆或长杆状菌体则不纯，要进一步分离纯化。将一个一个单菌落接入斜面无氮培养基培养备用。5、进一步证实将单菌落接入无氮培养基培养，确认其生长良好后，可进行固氮活性的测定。6、固氮活性的测定（1）先称好血清瓶重量，然后把斜面菌苔刮入血瓶内，再称重量，两者相减则为菌体鲜重（mg）。（2）用注射器从血清瓶中抽取6mL空气，然后注入6mL乙炔（C2H2）气体。（3）将血清瓶置于28℃~30℃下恒温反应3~4h，在反应过程中，要经常摇动瓶子，使瓶内气体充分与菌体接触。（4）用微量注射器抽取一定量的反应气体样品注入气相色谱仪Prorapak层析柱层析测定乙炔还和乙烯峰高，并记录结果。（5）结果计算1273K×CH整×注入C,H,(mL)x反应时气压mm22.4~273+反应温度C,H,峰76011×10°4反应时间（min）菌体鲜重（mg）=毫微克分子（nm）C,H4/mg·菌体鲜重·min五、注意事项乙还原乙烯测定时，要注意反应时间、温度和气压。六、实验报告1、分离纯化的菌休镜检结果。2、固氮活性测定结果。25
25 四、操作步骤 1、取样 用干净的铲子在表土下 5cm~10cm 之间，取少量土壤样品，放入干净的 平皿中或信封内。各种类型的土壤各取一份。 2、增殖培养 用干净的镊子取绿豆大小土壤，排放在无氮平板上，每种土壤样品排 放一个平板。置 28℃~30℃下培养 5~7d，观察土粒周围是否有褐色的粘稠液产生，若有 则进入下一步工作。 3、分离 采取平板划线分离，观察是否有褐色粘稠液的单个菌落。 4、镜检 取单个菌落材料制水片或干片后在显微镜下观察检查，菌体是否都为“8” 字形或球形菌体，如果是则此菌落是纯菌落，若含有其它形态如短杆或长杆状菌体则不 纯，要进一步分离纯化。将一个一个单菌落接入斜面无氮培养基培养备用。 5、进一步证实 将单菌落接入无氮培养基培养，确认其生长良好后，可进行固氮活 性的测定。 6、固氮活性的测定 （1）先称好血清瓶重量，然后把斜面菌苔刮入血瓶内，再称重量，两者相减则为菌 体鲜重（mg）。 （2）用注射器从血清瓶中抽取 6mL 空气，然后注入 6mL 乙炔（C2H2）气体。 （3）将血清瓶置于 28℃~30℃下恒温反应 3~4h，在反应过程中，要经常摇动瓶子， 使瓶内气体充分与菌体接触。 （4）用微量注射器抽取一定量的反应气体样品注入气相色谱仪 Prora pak 层析柱层 析测定乙炔还和乙烯峰高，并记录结果。 （5）结果计算 2 4 2 2 2 2 1 273 ( ) 22.4 273 760 C H mm K C H mL C H + 峰 反应时气压 注入 峰 反应温度 1 1 6 10 min) ) mg 反应时间( 菌体鲜重( 4 =毫微克分子（nm）C2H4/mg·菌体鲜重·min 五、注意事项 乙炔还原乙烯测定时，要注意反应时间、温度和气压。 六、实验报告 1、分离纯化的菌休镜检结果。 2、固氮活性测定结果