3、进行此实验后的体会七、思考题1、为什么要在表王下5cm~10cm之间王壤取样/2、在无氮培养基上生长的菌体都为圆褐固氮菌吗？为什么？3、根瘤菌能否应用无氮培养基来分离纯化？为什么？4、为什么固氮酶能把C2H2还原为C2H4?26
26 3、进行此实验后的体会 七、思考题 1、为什么要在表土下 5cm~10cm 之间土壤取样/ 2、在无氮培养基上生长的菌体都为圆褐固氮菌吗？为什么？ 3、根瘤菌能否应用无氮培养基来分离纯化？为什么？ 4、为什么固氮酶能把 C2H2 还原为 C2H4?
实验6从病鱼体上分离、纯化病原菌一、目的学习从发病动物体上分离、纯化病原体的方法。二、原理动物发生疾病，有可能是感染了病原微生物。我们可以从发病动物体上分离、纯化到的有关细菌，进行感染正常健康动物体，出现同样的病症病状，就初步证实该细菌为该病的病原体；再一次的感染，同样发生一样的症状，就可证实该细菌为该病的病原体。对病原体进行分类鉴定和其它方面的试验。本实验介绍从病鱼体上分离病原细菌的方法。三、材料、试剂与器具1.材料病鱼材料，正常健康鱼，胰蛋白陈培养基平板和斜面试管。2.试剂75%的酒精棉球，无菌0.85%的生理盐水。3.器具吸水纸，解剖刀，剪刀，镊子，接种工具，酒精灯，超净工作台，无菌注射器（含水5号针头）水族箱等。四、操作步媒1.解剖取典型症状的濒死的病鱼，用吸水纸擦干体表，用75%酒精消毒后按常规无菌操作方法把鱼解剖开。2.取样培养用灭菌过的接种针取一小块病鱼的肝、脾、肾组织接种于胰蛋白陈斜面试管上，28℃下培养24~48h。3分离纯化把斜面长出的菌作平板划线分离培养后，从菌落中挑选优势典型菌落接种到斜面上培养。如果菌落分离不理想，要再进行划线分离，直至获得单个菌落为止。4感染试验把上述分离的单菌落的材料，用生理盐水配制成一定浓度的菌悬液.用无菌注射器（含水5号针头）把一定量的菌悬液注射到健康鱼的腹腔内在水族箱内饲养，观察记录鱼发病情况。5。重新分离、感染挑选发病最严重的病鱼重复1~4步骤，再次证实该菌株是该病毒性最强的病原菌菌株。6。分类鉴定经过分离、纯化、感染证实毒性最强的菌株，要进行菌落形态、个体形态、一系列的生理生化等试验鉴定出病原菌的种属。然后保存于安焙瓶备用。五、注意事项27
27 实验 6 从病鱼体上分离、纯化病原菌 一、目的 学习从发病动物体上分离、纯化病原体的方法。 二、原理 动物发生疾病，有可能是感染了病原微生物。我们可以从发病动物体上分离、纯化 到的有关细菌，进行感染正常健康动物体，出现同样的病症病状，就初步证实该细菌为该 病的病原体；再一次的感染，同样发生一样的症状，就可证实该细菌为该病的病原体。对 病原体进行分类鉴定和其它方面的试验。本实验介绍从病鱼体上分离病原细菌的方法。 三、材料、试剂与器具 1． 材料 病鱼材料，正常健康鱼，胰蛋白胨培养基平板和斜面试管。 2． 试剂 75%的酒精棉球，无菌 0.85%的生理盐水。 3． 器具 吸水纸，解剖刀，剪刀，镊子，接种工具，酒精灯，超净工 作台，无菌注射器（含水 5 号针头）水族箱等。 四、操作步骤 1． 解剖 取典型症状的濒死的病鱼，用吸水纸擦干体表，用 75%酒精 消毒后按常规无菌操作方法把鱼解剖开。 2． 取样培养 用灭菌过的接种针取一小块病鱼的肝、脾、肾组织接种 于胰蛋白胨斜面试管上，28℃下培养 24~48h。 3． 分离纯化 把斜面长出的菌作平板划线分离培养后，从菌落中挑选 优势典型菌落接种到斜面上培养。如果菌落分离不理想，要再进行划线分离，直至获得单 个菌落为止。 4． 感染试验 把上述分离的单菌落的材料，用生理盐水配制成一定浓 度的菌悬液,用无菌注射器(含水 5 号针头)把一定量的菌悬液注射到健康鱼的腹腔内,在水 族箱内饲养,观察记录鱼发病情况。 5． 重新分离、感染 挑选发病最严重的病鱼重复 1~4 步骤，再次证实 该菌株是该病毒性最强的病原菌菌株。 6． 分类鉴定 经过分离、纯化、感染证实毒性最强的菌株，要进行菌 落形态、个体形态、一系列的生理生化等试验鉴定出病原菌的种属。然后保存于安焙瓶备 用。 五、注意事项
病鱼样品不能选取死得过久的病鱼进行分离病原菌。六、实验报告1.描述自然发病的病鱼病症病状与人工感染的病症病状。2.描述经过感染证实为病原菌的菌落、个体形态。七、思考题1.分离、纯化病原菌为会么要进行人工感染试验？2.鱼类病原菌的分离、纯化有何意义？28
28 病鱼样品不能选取死得过久的病鱼进行分离病原菌。 六、实验报告 1．描述自然发病的病鱼病症病状与人工感染的病症病状。 2．描述经过感染证实为病原菌的菌落、个体形态。 七、思考题 1．分离、纯化病原菌为会么要进行人工感染试验？ 2．鱼类病原菌的分离、纯化有何意义？
实验7噬菌体分离、纯化与效价的测定I、噬菌体分离、纯化一、目的掌握噬菌体分离和纯化的方法。二、原理因为噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现其特异的噬菌体的存在，例如粪便与粪池排污水中含有大量大肠杆菌，故也能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。由于噬菌体DNA（或RNA）侵入细菌细胞后进行复制、转录和一系列基因的表达并装配成噬菌体颗粒后，通过裂解宿主细胞或通过“挤出(exclude)”宿主细胞（宿主细胞不被杀死，如M13噬菌体）而释放出来。所以，（1）在液体培养基内可使混浊的菌悬液变为澄清或比较清，此现象称为溶菌现象，可指示有噬菌体存在：也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的噬菌体：（2）在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被感染细菌的生长从而形成透明的或混浊的空斑，称噬菌斑（图7-1），一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体效价。本实验是从粪池排污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚分离出的噬体常不纯，如表现在噬菌斑的形态、大小不一致等，然后再作进一步纯化。29
29 实验 7 噬菌体分离、纯化与效价的测定 Ⅰ、噬菌体分离、纯化 一、目的 掌握噬菌体分离和纯化的方法。 二、原理 因为噬菌体是专性寄生物，所以自然界中凡有细菌分布的地方，均可发现其特异的 噬菌体的存在，例如粪便与粪池排污水中含有大量大肠杆菌，故也能很容易地分离到大 肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等。 由于噬菌体 DNA（或 RNA）侵入细菌细胞后进行复制、转录和一系列基因的表达并 装配成噬菌体颗粒后，通过裂解宿主细胞或通过“挤出(exclude)”宿主细胞（宿主细胞不 被杀死，如 M13 噬菌体）而释放出来。所以，（1）在液体培养基内可使混浊的菌悬液变 为澄清或比较清，此现象称为溶菌现象，可指示有噬菌体存在；也可利用这一特性，在样 品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的 噬菌体；（2）在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被感染细菌 的生长从而形成透明的或混浊的空斑，称噬菌斑（图 7-1），一个噬菌体产生一个噬菌斑， 利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体效价。 本实验是从粪池排污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚分离出的噬体常不纯，如表现在 噬菌斑的形态、大小不一致等，然后再作进一步纯化
品尚体上路洗料液理合物侧在晾脂平板上养源压图7-1更年平板置量技术进行掌医班实验来对细菌疾毒逆量，（稀释的病毒材科悬承浓和软感的宿主细菁及旗融化的晾背混合：将仓物铺在营养琼脂平板表面，帝主菌均时地铺满上层琼胎，开始生长：培养过夜唇形成成老荞臻照利片的菌苗：每个与细胆吸附并发生复创的病毒题粒会造成三明治形物细胞裂解。病毒颗粒称放出来并扩散到琼脂上近的细胞培养感染并复制热后又导致裂解和称放。形成壁菌班的大小取决于病毒、宿主和培养条件。（6）平板的照并显示噬菌体盛菌斑在敏感细菌菌者上形成噬菌班，噬菌班的直径为12mm三、材料、试剂与器具1.材料大肠杆菌，粪池排污水，500mL三角烧瓶内装三倍浓度的普通肉膏蛋白陈液体培养基100mL，试管液体培养基，上层琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管4mL），底层琼脂平板（含培养基10mL，琼脂2%）：2.灭菌玻璃刮，灭菌滤器（孔径0.22μm），恒温水浴箱，真空泵等。四、操作步骤1、噬菌体的分离（1）制备菌悬液37℃培养18h的大肠杆斜面一支，加4mL无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。（2）增殖培养于100mL三倍浓缩的牛肉膏蛋白陈液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200mL与大肠杆菌悬液2mL，37℃200r/min振荡培养12~24h。（3）制备裂解液将以上混合培养液2500r/min离心15min。将无菌滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，常规操作连接真空抽滤装置（如图7-2）。将离心上清液倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液接种到斜面培养基上，经37℃培养过夜，以作无菌检查。30
30 三、材 料、试剂与 器具 1．材料 大肠杆菌，粪池排污水，500mL 三角烧瓶内装三倍浓 度的普通肉膏蛋白胨液体培养基 100mL，试管液体培养基，上层琼脂培养基（含琼脂 0.7%， 试管分装，每管 4mL），底层琼脂平板（含培养基 10mL,琼脂 2%）； 2．灭菌玻璃刮，灭菌滤器（孔径 0.22μm），恒温水浴箱， 真空泵等。 四、操作步骤 1、噬菌体的分离 （1）制备菌悬液 37℃培养 18h 的大肠杆斜面一支，加 4mL 无菌水洗下菌苔，制成 菌悬液。 （2）增殖培养 于 100mL 三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，加 入污水样品 200mL 与大肠杆菌悬液 2mL，37℃200r/min 振荡培养 12~24h。 （3）制备裂解液 将以上混合培养液 2500r/min 离心 15min。 将无菌滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，常规操作连接真空抽滤装置（如图 7- 2）。将离心上清液倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液接种到斜面培养基上，经 37℃培养过夜，以作无菌检查