表2-2干热湿热穿透力及灭菌效果比较温度/℃灭菌时间/h透过布层的温度/℃20层10层100层867270.5不完全干热130-14043101101101完全湿热105.3表2-3灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系压力数全部空2/3空气1/2空气空气全1/3空气气排出排出时排出时排出时不排出Kg/cm?Ib/in?时的温的温度的温度的温度时的温Mpa/℃IC/℃度/℃度/℃59490720.030.35108.810010109900.070.70115.610510010.5151151120.10121.3109100201211150.141.40126.2118109251261241211150.171.75130.0301301281261210.212.10134.6现在法定压力单位已不用Ib/in?和kg/cm?表示，而是用Pa或bar表示，其换算关系为：1kg/cm2=98066.5Pa,1Ib/in?=6894.76Pa.一般培养基用0.1Mpa（相当于15Ib/in2或1.05kg/cm2），121.5℃，15~30min可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而定。例如含糖培养基用0.06Mpa(8Ib/in2或0.59kg/cm)112.6℃灭菌：又如斜面试管培养基以0.1Mpa，121.5℃时灭菌20min即可，而盛于大瓶内的培养基最好灭菌30min为宜。实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式（图2-1）和手提式（图2-2）二种，其结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书。11
11 表 2-2 干热湿热穿透力及灭菌效果比较 温度/℃ 时间/h 透过布层的温度/℃ 灭菌 20 层 10 层 100 层 干热 130-140 4 86 72 70.5 不完全 湿热 105.3 3 101 101 101 完全 表 2-3 灭菌锅留有不同分量空气时，压力与温度的关系 压力数 全部空 气排出 时的温 度/℃ 2/3 空气 排出时 的温度 /℃ 1/2 空气 排出时 的温度 /℃ 1/3 空气 排出时 的温度 /℃ 空气全 不排出 时的温 度/℃ Mpa Kg/cm2 Ib/in2 0.03 0.35 5 108.8 100 94 90 72 0.07 0.70 10 115.6 109 105 100 90 0.10 10.5 15 121.3 115 112 109 100 0.14 1.40 20 126.2 121 118 115 109 0.17 1.75 25 130.0 126 124 121 115 0.21 2.10 30 134.6 130 128 126 121 现在法定压力单位已不用 Ib/in2 和 kg/cm2 表示，而是用 Pa 或 bar 表示，其换算关系 为：1kg/cm2=98066.5Pa; 1Ib/in2=6894.76Pa. 一般培养基用 0.1Mpa（相当于 15Ib/in2 或 1.05kg/cm2），121.5℃,15~30min 可达到彻 底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而定。例 如含糖培养基用 0.06Mpa(8Ib/in2 或 0.59kg/cm2 )112.6℃灭菌；又如斜面试管培养基以 0.1Mpa，121.5℃时灭菌 20min 即可，而盛于大瓶内的培养基最好灭菌 30min 为宜。 实验中常用的非自控高压蒸气灭菌锅有卧式（图 2-1）和手提式（图 2-2）二种，其 结构和工作原理相同，本实验以手提式高压蒸灭菌锅为例，介绍其使用方法，有关自控高 压蒸气灭菌锅（autoclave）的使用可参照厂家说明书
气排气图一服授计阀两气供应阀燕气选口8示意图灭菌钢外形图2-1卧式灭菌锅图2-2手提式灭菌锅三、材料、试剂与器具1.材料牛肉膏蛋白陈培养基。2.器具培养皿（6套一包），手提式高压蒸气灭菌锅等。四、操作步骤1.加水：加入锅内的水加到所要的水量，切勿少了。2.把要灭菌的材料装入锅内，需要灭菌的器材，培养基的棉塞等都应用纸包好，这样即可防止棉塞被锅内的水气湿透，又可减少灭菌后被空气中的杂菌污染。放入锅内的材料要摆得疏松，不可太紧，否则会使蒸汽的流通不畅，影响灭菌效果。瓶口管口均不要贴住锅壁，以免冷凝水湿透棉塞。3.灭菌材料放好后，关严灭菌锅盖和其他阀门，勿使漏气。4，通电加热，水沸腾以后，灭菌锅内的压力就逐步上升到0.05MPa时，打开放气阀门，把锅内的冷空气放尽，待压力降为“0”时，关紧放气阀门，继续加热，直到压力升到0.105MPa（15Ib/in2或1.05kg/cm2亦是121℃），保持15~30min。在灭菌期间内要不断调节热源大小，使压力要维持所需的压力。一般的高压蒸汽锅都有安全阀，就是压力升到一定程度时，它就会自动放气，使压力维持安全压力以下，在灭菌放气时，安全阀门千万不要动它。5.灭菌完毕后，切断电源。此后，温度逐渐下降，大量蒸汽逐渐凝结成水，而压力下降。6.待压力降至“0”时，打开放汽阀。注意排气不能过早，否则突然降压而致使培养基沸腾，使棉塞沾污，甚至使玻璃瓶裂开。7.旋开螺栓，打开灭菌锅盖，取出已灭好菌的器皿及培养基。12
12 三、材料、试剂与器具 1． 材料 牛肉膏蛋白胨培养基。 2． 器具 培养皿（6 套一包），手提式高压蒸气灭菌锅等。 四、操作步骤 1．加水：加入锅内的水加到所要的水量，切勿少了。 2．把要灭菌的材料装入锅内，需要灭菌的器材，培养基的棉塞等都应用纸包好，这 样即可防止棉塞被锅内的水气湿透，又可减少灭菌后被空气中的杂菌污染。放入锅内的 材料要摆得疏松，不可太紧，否则会使蒸汽的流通不畅，影响灭菌效果。瓶口管口均不要 贴住锅壁，以免冷凝水湿透棉塞。 3．灭菌材料放好后，关严灭菌锅盖和其他阀门，勿使漏气。 4．通电加热，水沸腾以后，灭菌锅内的压力就逐步上升到 0.05MPa 时，打开放气阀 门，把锅内的冷空气放尽，待压力降为“0”时，关紧放气阀门，继续加热，直到压力升 到 0.105MPa（15Ib/in2 或 1.05kg/cm2，亦是 121℃），保持 15~30min。在灭菌期间内要不断 调节热源大小，使压力要维持所需的压力。一般的高压蒸汽锅都有安全阀，就是压力升到 一定程度时，它就会自动放气，使压力维持安全压力以下，在灭菌放气时，安全阀门千万 不要动它。 5．灭菌完毕后，切断电源。此后，温度逐渐下降，大量蒸汽逐渐凝结成水，而压力 下降。 6．待压力降至“0”时，打开放汽阀。注意排气不能过早，否则突然降压而致使培 养基沸腾，使棉塞沾污，甚至使玻璃瓶裂开。 7．旋开螺栓，打开灭菌锅盖，取出已灭好菌的器皿及培养基。 图 2-1 卧式灭菌锅 图 2-2 手提式灭菌锅
需摆斜面的则摆成斜面，需倒平板的则在超净工作台内倒平板。然后放入37C温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。五、注意事项：1.在灭菌过程中，一定要有人在，切勿人跑走，以免发生事故。2.一定要先放水，后通电，以免烧坏灭菌锅。3：锅内冷空气一定要排尽，否则会影响灭菌效果。六、实验报告检查培养基灭菌是否彻底。七、思考题1.高压蒸气灭菌时，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？2.在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？3.灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？4.黑曲霉的孢子或芽孢杆菌的孢子杀死，所需的温度一样吗？为什么？ⅡI紫外线灭菌一、目的了解紫外线灭菌的原理和使用方法二、原理紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，紫外线灯是充满氛气的灯管制成的。紫外线为非电离辐射，它可使被照射的分子或魔子中的内层电子提高能级，但不引起电离。波长为200~300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要因为它诱导了胸腺二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧（O）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢（H2O2）。O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，只杀死暴露的微生物，所以，只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物在1.2m以内灭菌效果好。此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前：可在无菌室内（或接种箱内）喷洒3%~5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%~3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。三、材料、试剂与器具13
13 需摆斜面的则摆成斜面，需倒平板的则在超净工作台内倒平板。然后放入 37℃温箱 培养 24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。 五、注意事项： 1．在灭菌过程中，一定要有人在，切勿人跑走，以免发生事故。 2．一定要先放水，后通电，以免烧坏灭菌锅。 3．锅内冷空气一定要排尽，否则会影响灭菌效果。 六、实验报告 检查培养基灭菌是否彻底。 七、思考题 1．高压蒸气灭菌时，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低 “0”时才能打开排气阀，开盖取物？ 2．在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？ 3．灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？ 4．黑曲霉的孢子或芽孢杆菌的孢子杀死，所需的温度一样吗？为什么？ Ⅲ 紫外线灭菌 一、目的 了解紫外线灭菌的原理和使用方法 二、原理 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，紫外线灯是充满氖气的灯管制成的。紫外线为非 电离辐射，它可使被照射的分子或魇子中的内层电子提高能级，但不引起电离。波长为 200~300nm 的紫外线都有杀菌能力，其中以 260nm 的杀菌力最强。在波长一定的条件下， 紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要因为它诱导了胸腺 嘧啶二聚体的形成和 DNA 链的交联，从而抑制了 DNA 的复制。另一方面，由于辐射能 使空气中的氧电离成[O]，再使 O2 氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成过氧化氢 （H2O2）。O3 和 H2O2 均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，只杀死暴露的微生物，所以， 只适用于无菌室，接种箱，手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物在 1.2m 以内灭菌效果好。 此外，为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯以前：可在无菌室内（或接种箱内） 喷洒 3%~5%石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可杀死 一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用 2%~3%的来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射， 即可增强杀菌效果，达到灭菌目的。 三、材料、试剂与器具
1.材料牛肉膏蛋白陈平板。2.试剂3%~5%石炭酸或2%~5%来苏尔溶液。3．器具装有紫外线灯的超净工作台或接种箱或无菌室。四、操作步骤1.检测单用紫外线照射灭菌效果（1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。（2）将牛肉膏蛋白陈平板置于无菌室或接种箱内，把盖打开15min，然后盖上皿盖。置30℃培养24h~48h。共做三套。（3）取出平板，检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。2．检测紫外线照射加化学消毒剂灭菌效果（1）在无菌室内或超净工作台，先喷3%~5%的石炭酸溶液，再打开紫外线灯照射30min。然后放入三套牛肉膏蛋白平板，打开皿盖15min后，盖上盖，置30℃下培养24~48h。（2）无菌室内的桌面、凳子用2%~3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射30min。同（1）做三套平板。（3）检查灭菌效果[方法同“单用紫外线照射”（3）]。五、注意事项因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有损伤和有刺激作用，故不能在开着紫外线灯光下工作。六、实验报告记录两种灭菌效果于下表中平板菌落数灭菌效果比较处理方法123紫外线照射紫外线照射+3%~5%石炭酸紫外线照射+2%~3%来苏儿七、思考题。（1）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线的抵抗力有何不同？为什么？（2）在紫外灯下观察实验结果时，为什么要隔一块普通玻璃？IV微孔滤膜过滤除菌一、目的14
14 1．材料 牛肉膏蛋白胨平板。 2．试剂 3%~5%石炭酸或 2%~5%来苏尔溶液。 3．器具 装有紫外线灯的超净工作台或接种箱或无菌室。 四、操作步骤 1．检测单用紫外线照射灭菌效果 （1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射 30min，将开关关闭。 （2）将牛肉膏蛋白胨平板置于无菌室或接种箱内，把盖打开 15min，然后盖上皿盖。 置 30℃培养 24h~48h。共做三套。 （3）取出平板，检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过 4 个，说明灭菌效果良 好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。 2．检测紫外线照射加化学消毒剂灭菌效果 （1）在无菌室内或超净工作台，先喷 3%~5%的石炭酸溶液，再打开紫外线灯照射 30min。然后放入三套牛肉膏蛋白胨平板，打开皿盖 15min 后，盖上盖，置 30℃下培养 24~48h。 （2）无菌室内的桌面、凳子用 2%~3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射 30min。 同（1）做三套平板。 （3）检查灭菌效果[方法同“单用紫外线照射”（3）]。 五、注意事项 因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有损伤和有刺激作用，故不能在开 着紫外线灯光下工作。 六、实验报告 记录两种灭菌效果于下表中 处理方法 平板菌落数 1 2 3 灭菌效果比较 紫外线照射 紫外线照射+3%~5%石炭酸 紫外线照射+2%~3%来苏儿 七、思考题。 （1）细菌营养体细胞和细菌芽孢对紫外线的抵抗力有何不同？为什么？ （2）在紫外灯下观察实验结果时，为什么要隔一块普通玻璃？ Ⅳ 微孔滤膜过滤除菌 一、目的
了解滤器的种类和滤除菌的原理：学习掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。二、原理过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。滤器主要有3种。一种是古老式的深度滤器。主要由纸、石棉或玻璃纤维交错而成的纤维状薄片，可将细菌细胞截留在内部的弯道内。第二种滤器是用厚度为10μm的聚碳酸酯经核辐射处理后的核孔滤器。（图2-3）第三种是最常用的滤器是微孔滤膜器，其装置如图2-4。下面仅介绍微孔滤膜过滤器的装置和原理。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，入口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖合，当溶液从针筒注入滤器过，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌图2-4b（左），若大量液体的过滤则采用图2-4b（右）。15
15 了解滤器的种类和滤除菌的原理；学习掌握微孔滤膜过滤除菌的方法。 二、原理 过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同 的滤器和滤板材料。滤器主要有 3 种。一种是古老式的深度滤器。主要由纸、石棉或玻璃 纤维交错而成的纤维状薄片，可将细菌细胞截留在内部的弯道内。第二种滤器是用厚度 为 10μm 的聚碳酸酯经核辐射处理后的核孔滤器。（图 2-3）第三种是最常用的滤器是微 孔滤膜器，其装置如图 2-4。下面仅介绍微孔滤膜过滤器的装置和原理。 微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口 处可连接针头，入口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖合，当溶 液从针筒注入滤器过，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。 根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏 溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的 过滤除菌图 2-4b（左），若大 量液体的过 滤则采用图2-4b （右）