《生物技术制药》实验指导 微量移液器、涡流混合器、低温高速离心机 【实验步骤】 1.取100mg/ml的氨苄青霉素201加入到20mlLB液体培养基(20ml/250ml 三角瓶)中，使氨苄青霉素的含量为100g/ml,分装到5×150mm试管中，每管3ml。 分别挑取实验一转化平板上的单菌落，接种到含有100gml氨苄青霉素的LB液体 培养基(3ml/试管)中（每组挑2个菌落）。37℃振荡培养过夜（约16小时）。 自下一步骤起不需无菌操作 2.取lml菌液于1.5 ml Eppendorf管中，3000r/min离心5分钟，弃去上清液， 湿菌体在涡流混合器上振荡均匀。 3.加入1001溶液1，摇匀。冰浴10分钟。 4.加入2001溶液Ⅱ，温和振荡，溶液变粘稠，而且清亮透明，冰浴10分钟。 5.加入1501溶液Ⅲ，温和振荡，出现白色沉淀，冰浴10分钟。 6.4℃10,000r/min离心10分钟，将上清液小心倒入另一个新Eppendorf管中， 加入8001预冷的无水乙醇。-20℃冰箱中放置1小时，沉淀DNA。 7.4℃10,000 r/min离心10分钟，弃去上清液，将Eppendorf管中所有液体挥发 干净。 8.加入201TE缓冲液溶解DNA。 【提示】 (一)一些试剂的生化作用原理 1.溶液1一溶菌液： ①溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的
《生物技术制药》实验指导 8 微量移液器、涡流混合器、低温高速离心机 【实验步骤】 1．取 100mg/ml 的氨苄青霉素 加入到 20ml LB 液体培养基（20ml/250ml 三角瓶）中，使氨苄青霉素的含量为 ，分装到 5×150mm 试管中，每管 3ml。 分别挑取实验一转化平板上的单菌落，接种到含有 氨苄青霉素的 LB 液体 培养基（3ml/试管）中（每组挑 2 个菌落）。37℃振荡培养过夜（约 16 小时）。 自下一步骤起不需无菌操作 2．取 1ml 菌液于 1.5ml Eppendorf 管中，3000r/min 离心 5 分钟，弃去上清液， 湿菌体在涡流混合器上振荡均匀。 3．加入 溶液 I，摇匀。冰浴 10 分钟。 4．加入 溶液 II，温和振荡，溶液变粘稠，而且清亮透明，冰浴 10 分钟。 5．加入 1 溶液 III，温和振荡，出现白色沉淀，冰浴 10 分钟。 6．4℃ 10,000r/min 离心 10 分钟，将上清液小心倒入另一个新 Eppendorf 管中， 加入 预冷的无水乙醇。-20℃冰箱中放置 1 小时，沉淀 DNA。 7．4℃ 10,000r/min 离心 10 分钟，弃去上清液，将 Eppendorf 管中所有液体挥发 干净。 8．加入 缓冲液溶解 DNA。 【提示】 （一）一些试剂的生化作用原理 1．溶液 I — 溶菌液： ① 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的
《生物技术制药》实验指导 -1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。其最适pH为8.0。 ②葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力作用而降解。 ③EDTA:螯合Mg+、Ca2+等金属离子，抑制DNase对DNA的降解作用。另 外，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度 的环境。 2.溶液I-NaOH-SDS液： ①NaOH:DNA在pH大于5、小于9的溶液中是稳定的。但当pH>I2或pH s3时就会引起双链之间的氢键解离而变性。溶液Ⅱ中的NaOH浓度为200mmol/L, 加到提取液中时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变 性。 ②SDS:SDS是离子型表面活性剂。它主要功能是溶解细胞膜上的脂质和蛋白， 因而溶解膜蛋白破坏细胞膜：解聚细胞中的核蛋白：SDS能与蛋白质结合成为 R-O-SO3一R一蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 3.溶液Ⅲ-3mol/L NaAc（pH4.8)溶液： NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸，所以该溶 液实际上是NaAc-Hac的缓冲液。用pH4.8的NaAc是为了把pH12.6的提取液调回至 pH中性，使变性的质粒DNA能够复性，并稳定存在。而高盐的3mol/L NaAc可以 中和核酸上的电荷，减少相斥力，有利于变性的大分子染色体DNA、RNA互相聚合 而沉淀下来，同时钠盐与SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物， 使沉淀更完全。 4.沉淀DNA 乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安
《生物技术制药》实验指导 9 -1,4 糖苷键，因而具有溶菌作用。其最适 pH 为 8.0。 ② 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械力作用而降解。 ③ EDTA：螯合 Mg2+、Ca2+ 等金属离子，抑制 DNase 对 DNA 的降解作用。另 外，EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度 的环境。 2．溶液 II— NaOH-SDS 液： ① NaOH：DNA 在 pH 大于 5、小于 9 的溶液中是稳定的。但当 pH﹥12 或 pH ﹤3 时，就会引起双链之间的氢键解离而变性。溶液 II 中的 NaOH 浓度为 200mmol/L， 加到提取液中时，该系统的 pH 就高达 12.6，因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变 性。 ② SDS：SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能是溶解细胞膜上的脂质和蛋白， 因而溶解膜蛋白破坏细胞膜; 解聚细胞中的核蛋白; SDS 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3 —···R +—蛋白质复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 3．溶液 III— 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液： NaAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至 4.8，必须加入大量的冰醋酸，所以该溶 液实际上是 NaAc-Hac 的缓冲液。用 pH4.8 的 NaAc 是为了把 pH12.6 的提取液调回至 pH 中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并稳定存在。而高盐的 3mol/L NaAc 可以 中和核酸上的电荷，减少相斥力，有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 互相聚合 而沉淀下来，同时钠盐与 SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物， 使沉淀更完全。 4．沉淀 DNA 乙醇可以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安
《生物技术制药》实验指导 全，因此是理想的DNA沉淀剂。DNA溶液中DNA是以水合状态稳定存在的，当加 入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失去水而易于聚合 (二)实验操作中注意的问题 1.该实验最重要的是去掉染色体DNA,在全部提取过程中，只有一次机会去除 染色体DNA,其关键步骤是加入溶液Ⅱ和溶液I时，控制变性与复性操作时机，既 要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性，又要使染色体DNA不断裂成小片段， 从而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力要适当。 一般加入溶液I时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与溶菌酶完全作用，染色体 DNA尚未释放出来，不必担心其分子断裂。加入SDS以后，必须注意不能过分用力 振荡，但又必须保证溶液混合充分，可上下颠倒Eppendorf管数次，直至混匀。 2.加入溶液Ⅱ5分钟后，如果溶液不变粘稠时，实验不能继续做下去，要检查 所用的试剂是否正确，数量是否符合，待找出原因改正后才可继续进行下去，否则， 提取到最后，将得不到质粒DNA或收率极低。 3.加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注意观察水相 和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。 【附录】 1.溶液1配制方法： 葡萄糖 0.991g 双蒸馏水 80ml 250mmol/L EDTA 4ml 1.0mol/L Tris-HCI pH8.0 2.5ml 用双蒸馏水定容至100ml,0.07Mpa高压灭菌20分钟，4℃保存，临用时加入 10
《生物技术制药》实验指导 10 全，因此是理想的 DNA 沉淀剂。DNA 溶液中 DNA 是以水合状态稳定存在的，当加 入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA 失去水而易于聚合。 （二）实验操作中注意的问题 1．该实验最重要的是去掉染色体 DNA，在全部提取过程中，只有一次机会去除 染色体 DNA，其关键步骤是加入溶液 II 和溶液 III 时，控制变性与复性操作时机，既 要使试剂与染色体 DNA 充分作用使之变性，又要使染色体 DNA 不断裂成小片段， 从而能与质粒 DNA 相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力要适当。 一般加入溶液 I 时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与溶菌酶完全作用，染色体 DNA 尚未释放出来，不必担心其分子断裂。加入 SDS 以后，必须注意不能过分用力 振荡，但又必须保证溶液混合充分，可上下颠倒 Eppendorf 管数次，直至混匀。 2．加入溶液 II 5 分钟后，如果溶液不变粘稠时，实验不能继续做下去，要检查 所用的试剂是否正确，数量是否符合，待找出原因改正后才可继续进行下去，否则， 提取到最后，将得不到质粒 DNA 或收率极低。 3．加入乙醇沉淀 DNA 时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注意观察水相 和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱中去沉淀 DNA。 【附录】 1．溶液 I 配制方法： 葡萄糖 0.991g， 双蒸馏水 80ml 250mmol/L EDTA 4ml 1.0mol/L Tris-HCl（pH8.0） 2.5ml 用双蒸馏水定容至 100ml，0.07Mpa 高压灭菌 20 分钟，4℃保存，临用时加入
《生物技术制药》实验指导 200mg溶菌酶。 2.溶液Ⅱ配制方法： 2mol/L NaOH 10ml 10% SDS 10ml 双蒸馏水 80ml 最好现用现配，不需灭菌。 实验三 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 【实验目的】 学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度、构型、含量和分子量大小。 【实验原理】 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂 糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA (cccDNA)、线性质粒DNA(L-DNA)和开环质粒DNA(ocDNA)。 OcDNA L-DNA cecDNA 11
《生物技术制药》实验指导 11 200mg 溶菌酶。 2．溶液 II 配制方法： 2mol/L NaOH 10ml 10% SDS 10ml 双蒸馏水 80ml 最好现用现配，不需灭菌。 实验三 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA 【实验目的】 学习水平式琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度、构型、含量和分子量大小。 【实验原理】 闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒 DNA 由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂 糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒 DNA （cccDNA）、线性质粒 DNA（L-DNA）和开环质粒 DNA（ocDNA）。 cccDNA ocDNA L-DNA
《生物技术制药》实验指导 图3-1提取的质粒DNA电泳图 【实验材料和试剂】 (一)实验样品 实验二提取的质粒pUC118 RNA (二)试剂 1. DNA/HindIII分子量标准 2.溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3.1mgml溴化乙锭溶液 4.电泳缓冲液(TAE) 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA 配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml0.5mol/L EDTA(pH8.0),定容 至5000ml。 5.0.7%琼脂糖凝胶 配制方法：称取琼脂糖0.35克，加入50 ml TAE电泳缓冲液。 (三)仪器 微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪 【实验步骤】 2
《生物技术制药》实验指导 12 图 3-1 提取的质粒 DNA 电泳图 【实验材料和试剂】 （一）实验样品 实验二提取的质粒 pUC118 （二）试剂 1． HindIII 分子量标准 2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 0.2% 溴酚蓝 50% 蔗糖 3．1mg/ml 溴化乙锭溶液 4．电泳缓冲液（TAE） 40 mmol/L Tris-乙酸 1 mol/L EDTA 配制方法：24.2 克 Tris 碱，5.71ml 冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容 至 5000ml。 5．0.7% 琼脂糖凝胶 配制方法：称取琼脂糖 0.35 克，加入 50ml TAE 电泳缓冲液。 （三）仪器 微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪 【实验步骤】 RNA