《生物技术制药》实验指导 1.选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极 的线路。 2.选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部 离电泳胶模底部的距离为1.0mm。 3.制备0.7%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。 4.用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶 板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻 倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3~5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡 可用吸管小心吸去。 5.琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端 的挡板，保持点样孔的完好。 6.将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝 胶表面1~2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。 7.将151DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液 不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上 样和估计电泳时间和判断电泳的位置。 8.用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 9.盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V1cm(100~150V恒压电泳)， 使DNA从负极向正极移动。 10.电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1~3小时。电泳完毕后关闭电 源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在254m波长 的透射紫外灯下观察。 13
《生物技术制药》实验指导 13 1．选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极 的线路。 2．选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部 离电泳胶模底部的距离为 1.0mm。 3．制备 0.7%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。 4．用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶 板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至 60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻 倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在 3～5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡 可用吸管小心吸去。 5．琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置 20 分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端 的挡板，保持点样孔的完好。 6．将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝 胶表面 1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。 7．将 样品与 1/5 体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液 不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上 样和估计电泳时间和判断电泳的位置。 8．用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 9．盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过 5V/cm（100～150V 恒压电泳）， 使 DNA 从负极向正极移动。 10．电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需 1～3 小时。电泳完毕后关闭电 源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在 254nm 波长 的透射紫外灯下观察
《生物技术制药》实验指导 【提示】 (一）琼脂糖凝胶电泳 1.琼脂糖凝胶的性质 琼脂糖是从海藻中提取的一种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L半乳糖的 残基交替排列组成的线型多聚糖。当琼脂糖加热至90~100℃左右，即可形成清亮透 明的液体。浇在模板上冷却至40~45℃时，凝固形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不 含有带电荷的基团，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好 的凝胶剂。琼脂糖凝胶可区分相差1OObp的DNA片段。 2.DNA分子的迁移率 DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的除了决定于DNA分子大小与构 型外，还有琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液H值和电泳时的温度等。 (二)实验操作中注意的问题 1.加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，使附于壁上的颗粒也完全溶解。 2.溴化乙锭是一种强致癌剂，并有中度毒性，因此必须十分谨慎小心。操作时 一定要戴手套，用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让污染有溴化乙锭的面朝里。 3.用254nm波长的紫外光进行观察的效果比366nm清晰，但产生的切口DNA 量也较高。紫外光对眼睛有害，观察时应戴上眼镜或防护面罩。 14
《生物技术制药》实验指导 14 【提示】 （一）琼脂糖凝胶电泳 1．琼脂糖凝胶的性质 琼脂糖是从海藻中提取的一种直链多糖，它由 D-半乳糖和 3,6-脱水-L-半乳糖的 残基交替排列组成的线型多聚糖。当琼脂糖加热至 90～100℃左右，即可形成清亮透 明的液体。浇在模板上冷却至 40～45℃时，凝固形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不 含有带电荷的基团，不引起 DNA 变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好 的凝胶剂。琼脂糖凝胶可区分相差 100bp 的 DNA 片段。 2．DNA 分子的迁移率 DNA 分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于 DNA 分子大小与构 型外，还有琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液 pH 值和电泳时的温度等。 （二）实验操作中注意的问题 1．加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，使附于壁上的颗粒也完全溶解。 2．溴化乙锭是一种强致癌剂，并有中度毒性，因此必须十分谨慎小心。操作时 一定要戴手套，用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让污染有溴化乙锭的面朝里。 3．用 254nm 波长的紫外光进行观察的效果比 366nm 清晰，但产生的切口 DNA 量也较高。紫外光对眼睛有害，观察时应戴上眼镜或防护面罩
《生物技术制药》实验指导 实验四 DNA的限制性内切酶酶切 【实验目的】 1.学会DNA限制性内切酶酶切技术。 2.琼脂糖凝胶电泳法观察酶切DNA的结果。 【实验原理】 质粒pUC118上有限制性内切酶BamHI的识别序列GJGATCC,用BamHI酶切 后形成线性质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳可以按酶切产物分子量的大小分离DNA片 段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子 量的对数成反比。要准确地确定DNA片段的大小，必须 用分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准 是DNA/EcoRI、DNA/HindIII、 DNA/EcoRI+HindIII 的酶切片段。 表4-1 噬菌体DNA的薛切片段(bp) EcoRI HindⅡ EcoRI+HindllⅡ 21,226 23,130 21,227 7,421 9.416 5,148 5,804 6,557 4,973 图+1pUC18酶切电图 5643 4,361 4,268 4,878 2,322 3,530 1.A DNA/HindIII 3.530 2,027 2,027 2.提取的pUC118样品 564 1,904 3.pUC118/BamHI 125 1,584 1,375 947 831 564 125 【实验材料和试剂】 5
《生物技术制药》实验指导 15 实验四 DNA 的限制性内切酶酶切 【实验目的】 1. 学会 DNA 限制性内切酶酶切技术。 2. 琼脂糖凝胶电泳法观察酶切 DNA 的结果。 【实验原理】 质粒 pUC118 上有限制性内切酶 BamHI 的识别序列 G↓GATCC，用 BamHI 酶切 后形成线性质粒 DNA。琼脂糖凝胶电泳可以按酶切产物分子量的大小分离 DNA 片 段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子 量的对数成反比。要准确地确定 DNA 片段的大小，必须 用分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准 是 DNA/EcoRI、 HindIII、 EcoRI+HindIII 的酶切片段。 表 4-1 噬菌体 DNA 的酶切片段（bp） EcoRI HindIII EcoRI+HindIII 21 ,226 7 ,421 5 ,804 5 ,643 4 ,878 3 ,530 23 ,130 9 ,416 6 ,557 4 ,361 2 ,322 2 ,027 564 125 21 ,227 5 ,148 4 ,973 4 ,268 3 ,530 2 ,027 1 ,904 1 ,584 1 ,375 947 831 564 125 【实验材料和试剂】
《生物技术制药》实验指导 (一)实验材料 实验二提取的质粒pUC118 （二)试剂 1.限制性内切酶BamHI 2.DNA/HindIII分子量标准 3.双蒸馏无菌水 4.溴酚蓝指示剂点样缓冲液 5.1mg/ml溴化乙锭溶液 6.电泳缓冲液(TAE) 7.0.7%琼脂糖凝胶（用TAE电泳缓冲液配制） （三)器材 l.5 ml Eppendorf管 2001吸头 (四)仪器 微量移液器、离心机、恒温水浴锅、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪 【实验步骤】 1.取一个灭菌的Eppendorf管，依次加入下列试剂： 双蒸馏无菌水 121 10×BamHI缓冲液 21 质粒pUC118 51 BamHI 11 总体积 201 2.用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。 l16
《生物技术制药》实验指导 16 （一）实验材料 实验二提取的质粒 （二）试剂 1．限制性内切酶 BamHI 2．DNA/HindIII 分子量标准 3．双蒸馏无菌水 4．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 5．1mg/ml 溴化乙锭溶液 6．电泳缓冲液（TAE） 7．0.7% 琼脂糖凝胶（用 TAE 电泳缓冲液配制） （三）器材 1.5ml Eppendorf 管 吸头 （四）仪器 微量移液器、离心机、恒温水浴锅、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪 【实验步骤】 1. 取一个灭菌的 Eppendorf 管，依次加入下列试剂： 双蒸馏无菌水 10×BamHI 缓冲液 质粒 pUC118 BamHI 总体积 20 l 2. 用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液
《生物技术制药》实验指导 3.置37℃水浴60~120分钟。 4.加入51溴酚蓝指示剂点样缓冲液，按实验三方法电泳，观察酶切反应结果， 鉴定酶切效果。 【提示】 实验操作中注意的问题 1.酶切反应用的Eppendorf管和吸头，都要用新的，用双蒸馏水洗净，灭菌。 使用前打开包装，用镊子夹取，不要直接用手去拿，以防手上的杂酶污染。 2.DNA样品和限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全 部放入反应体系中。 3.要注意酶切加样的次序，一般次序为双蒸馏无菌水、缓冲液、DNA各项试剂， 最后才加酶。 4.取酶时，吸头要从酶液的表面吸取，以防止吸头沾上过多的酶液。待用的酶 要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。 5.当样品在37℃保温时，要将Eppendorf管的盖子盖紧，防止因盖子未盖严密 使水进入管内，造成实验失败。 17
《生物技术制药》实验指导 17 3. 置 37℃水浴 60～120 分钟。 4. 加入 溴酚蓝指示剂点样缓冲液，按实验三方法电泳，观察酶切反应结果， 鉴定酶切效果。 【提示】 实验操作中注意的问题 1．酶切反应用的 Eppendorf 管和吸头，都要用新的，用双蒸馏水洗净，灭菌。 使用前打开包装，用镊子夹取，不要直接用手去拿，以防手上的杂酶污染。 2．DNA 样品和限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全 部放入反应体系中。 3．要注意酶切加样的次序，一般次序为双蒸馏无菌水、缓冲液、DNA 各项试剂， 最后才加酶。 4．取酶时，吸头要从酶液的表面吸取，以防止吸头沾上过多的酶液。待用的酶 要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。 5．当样品在 37℃保温时，要将 Eppendorf 管的盖子盖紧，防止因盖子未盖严密 使水进入管内，造成实验失败