《生物技术制药》实验指导 感受态是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态。用CaCI2处理细菌，改 变细胞膜的结构，使质粒DNA能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性培养基 中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。 本实验采用质粒pUC118转化大肠杆菌DH-5,通过氨苄青霉素抗性筛选转化 :118/pUC119 cloning site pUC118/pUC119 (3,162bp) S-GAATTCGAGCTCGGTACCCOGOGATCCTCTAGAGTCOACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3 1Ss683B71 -GCCAAGCTTOCATOCCTOCAOOTCOACTCTAOANGATCCCCOOOTACCOAOCTCOMAT SeeB387 1 S 子。 图1-1质粒pUC118/pUC119图谱 【实验材料和试剂】 (一)实验材料 大肠杆菌DH-5、质粒pUC118(ampicillin,AmpR) (二)培养基和试剂 1.LB液体培养基(%) 胰蛋白胨(Tryptone) 0.5 酵母浸出粉(Yeast extract) 1.0 NaCl 0.5 pH7.2~7.4(用2mol/L NaOH调节)
《生物技术制药》实验指导 3 感受态是受体菌能接受外源 DNA 能力的一种生理状态。用 CaCl2 处理细菌，改 变细胞膜的结构，使质粒 DNA 能够穿过细菌细胞膜进入细胞。然后在选择性培养基 中培养转化处理过的细菌，转化成功的细菌可以在选择性培养基上生长形成菌落。 本实验采用质粒 pUC118 转化大肠杆菌 DH- ，通过氨苄青霉素抗性筛选转化 子。 图 1-1 质粒 pUC118/pUC119 图谱 【实验材料和试剂】 （一）实验材料 大肠杆菌 DH- 、质粒 pUC118（ampicillin，AmpR） （二）培养基和试剂 1. LB 液体培养基(%) 胰蛋白胨（Tryptone） 0.5 酵母浸出粉（Yeast extract） 1.0 NaCl 0.5 pH 7.2～7.4（用 2mol/L NaOH 调节）
《生物技术制药》实验指导 (分装：20ml/250ml三角瓶，每组2瓶。3ml/试管，每组2管。0.07Mpa高压 灭菌30分钟)。 2.LB固体培养基 LB液体培养基加入1.6%的琼脂粉即可。 (分装：50ml/250ml三角瓶，加入0.8克琼脂粉，每组1瓶。0.07Mpa高压灭 菌30分钟)。 3.抗生素：氨苄青霉素(ampicillin,Amp)）,配制成100mg/ml备用。 4.0.1mol/LCaC2溶液 配制方法称取1.1克无水CaCl2,溶于90ml蒸馏水中定容至100ml装于250ml 三角瓶中，0.07Mpa高压灭菌30分钟，4℃保存。 (三)器材 接种针、10ml移液管、50ml塑料离心管、5ml移液管、90mm培养皿、1ml移液 管、1.5 ml Eppendorf管、2001吸头、三角爬、15×150试管、冰块、试管铝帽、牛皮 纸、纱布盖、线绳、硫酸纸。 (四)仪器 净化工作台、摇床机、恒温水浴锅、离心机、培养箱 【实验步骤】 (一)感受态细胞的制备 1.大肠杆菌DH5冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在LB固体培养基平 板上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）。 2.从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有3mlLB液体培养基的试管中， 37℃振荡培养过夜（约16小时）
《生物技术制药》实验指导 4 （分装：20ml/250ml 三角瓶，每组 2 瓶。3ml/试管，每组 2 管。0.07Mpa 高压 灭菌 30 分钟）。 2. LB 固体培养基 LB 液体培养基加入 1.6%的琼脂粉即可。 （分装：50ml/250ml 三角瓶，加入 0.8 克琼脂粉，每组 1 瓶。0.07Mpa 高压灭 菌 30 分钟）。 3. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin,，Amp），配制成 100mg/ml 备用。 4. 0.1mol/L CaCl2溶液 配制方法：称取 1.1 克无水 CaCl2，溶于 90ml 蒸馏水中，定容至 100ml，装于 250ml 三角瓶中，0.07Mpa 高压灭菌 30 分钟，4℃保存。 （三）器材 接种针、10ml 移液管、50ml 塑料离心管、5ml 移液管、90mm 培养皿、1ml 移液 管、1.5ml Eppendorf 管、200 l 吸头、三角爬、15×150 试管、冰块、试管铝帽、牛皮 纸、纱布盖、线绳、硫酸纸。 （四）仪器 净化工作台、摇床机、恒温水浴锅、离心机、培养箱 【实验步骤】 （一）感受态细胞的制备 1. 大肠杆菌 DH- 冷冻保存的菌种，挑取一环，划线接种在 LB 固体培养基平 板上（活化菌种），37℃培养过夜（约 16 小时）。 2. 从长好的平板上挑取一个单菌落，转接在含有 3ml LB 液体培养基的试管中， 37℃振荡培养过夜（约 16 小时）
《生物技术制药》实验指导 3.取0.3ml菌液接种于20mlLB液体培养基的250ml三角瓶中37℃振荡培养2~ 3小时，待0D6oo值达到0.3~0.4时，取下三角瓶，立即置冰浴10~15分钟。 4.将细菌转移到一个灭菌的50ml离心管中，4℃3000r/min离心10分钟，弃去 上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。 5.加入20ml用冰预冷的0.1mol/LCaC12溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀， 置冰浴中30分钟。 6.4℃3000r/min离心10分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。 7.再加入2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。 在4℃冰箱中放置12~24小时，即可应用于DNA转化。 (二)细菌的转化 1.取大肠杆菌DH-5新鲜感受态细胞1001于1.5 ml Eppendorf管中加入50~ 100ng质粒pUC118DNA,轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置30分钟。 2.42℃热休克120秒，不要摇动Eppendorf管。 3.加入LB液体培养基9001,37℃保温60分钟。 4.取1001转化液涂布在含氨苄青霉素(（Amp)100gml的LB固体平板上， 37℃倒置培养16~24小时。 5.观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。 【提示】 实验操作中注意的问题 1.DNA与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低， 转化效率极差。 2.Eppendorf管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染
《生物技术制药》实验指导 5 3. 取0.3ml菌液接种于20ml LB液体培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养2～ 3 小时，待 OD600 值达到 0.3～0.4 时，取下三角瓶，立即置冰浴 10～15 分钟。 4. 将细菌转移到一个灭菌的 50ml 离心管中，4℃ 3000r/min 离心 10 分钟，弃去 上清液（尽可能将所有的上清液去净），收集菌体。 5. 加入 20ml 用冰预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液，重新悬浮菌体，使菌体分散均匀， 置冰浴中 30 分钟。 6. 4℃ 3000r/min 离心 10 分钟，弃去上清液（尽可能将所有的上清液去净）。 7. 再加入 2ml 用冰预冷的 0.1mol/L CaCl2 溶液，小心重新悬浮菌体（操作要轻）。 在 4℃冰箱中放置 12～24 小时，即可应用于 DNA 转化。 （二）细菌的转化 1. 取大肠杆菌 DH- 新鲜感受态细胞 于 1.5ml Eppendorf 管中，加入 50～ 100ng 质粒 pUC118 DNA，轻轻旋转以混合内容物，在冰浴中放置 30 分钟。 2. 42℃热休克 120 秒，不要摇动 Eppendorf 管。 3. 加入 LB 液体培养基 ，37℃保温 60 分钟。 4. 取 转化液涂布在含氨苄青霉素（Amp） 的 LB 固体平板上， 37℃倒置培养 16～24 小时。 5．观察平板，长出的菌落可能就是转化子，可进一步提取质粒鉴定。 【提示】 实验操作中注意的问题 1. DNA 与感受态细胞混合后，一定要在冰浴条件下操作，如果温度时高时低， 转化效率极差。 2. Eppendorf 管盖紧，以免反应液溢出或外面水进入而污染
《生物技术制药》实验指导 3.42℃热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。 4.涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化， 过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 实验二碱变性法提取质粒DNA 【实验目的】 提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。 【实验原理】 碱变性提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达 到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构 解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链 不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒 DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状 结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起 沉淀下来而被除去。 【实验材料和试剂】 (一)实验材料 6
《生物技术制药》实验指导 6 3. 42℃热处理时很关键，转移速度要快，但温度要准确。 4. 涂布转化液时，要避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化， 过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 实验二 碱变性法提取质粒 DNA 【实验目的】 提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法。 【实验原理】 碱变性提取质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达 到分离目的。在 pH 高达 12.6 的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构 解开而变性。质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链 不会完全分离，当以 pH4.8 的 NaAc 高盐缓冲液去调节其 pH 至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状 结构，通过离心，染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起 沉淀下来而被除去。 【实验材料和试剂】 （一）实验材料
《生物技术制药》实验指导 大肠杆菌DH-5（pUC118)（使用实验一转化平板上的菌)。 (二)培养基和试剂 1.LB液体培养基 同实验一。 2.抗生素：氨苄青霉素(ampicillin,.Amp）,配制成100mgml备用。 3.溶液1： 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris-HCI pH8.0 10mmol/L EDTA pH8.0) 2mg/ml 溶菌酶 4.溶液Ⅱ： 200mmol/L NaOH 1% SDS 5.溶液Ⅲ： 3mol/L NaAc（pH4.8)溶液 6.TE缓冲液： 10mmol/L Tris-HCI pH8.0 1mmol/L EDTA 7.预冷的无水乙醇 （三)器材 接种针、1ml移液管、1.5 ml Eppendorf管、2001吸头、冰块、牛皮纸、纱布盖、 线绳 (四)仪器 >
《生物技术制药》实验指导 7 大肠杆菌 DH- （pUC118）（使用实验一转化平板上的菌）。 （二）培养基和试剂 1. LB 液体培养基 同实验一。 2. 抗生素：氨苄青霉素（ampicillin, Amp），配制成 100mg/ml 备用。 3. 溶液 I ： 50mmol/L 葡萄糖 25mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 10mmol/L EDTA（pH8.0） 2mg/ml 溶菌酶 4. 溶液 II ： 200mmol/L NaOH 1% SDS 5. 溶液 III ： 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液 6. TE 缓冲液 ： 10mmol/L Tris-HCl（pH8.0） 1mmol/L EDTA 7. 预冷的无水乙醇 （三）器材 接种针、1ml 移液管、1.5ml Eppendorf 管、200 l 吸头、冰块、 牛皮纸、纱布盖、 线绳 （四）仪器