微镜下观察。在高倍镜下可看到许多微小的细胞，即为鸡红细胞：稍大一些 的染成淡兰色的细胞为豚鼠的巨噬细胞。仔细观察可看到巨噬细胞吞噬鸡红 细胞的不同阶段的情况。 (二)红细胞的通透性实验 1、原理：将红细胞置于各种等渗液中，根据细胞膜对各种溶质选择通 透能力的不同，有的溶质分子可透入细胞膜，并使细胞内的盐浓度高于细胞 外，产生渗透压，并使细胞膜胀破，产生溶血现象。而有的溶质分子则不能 通诱过细胞膜，红细跑不破裂。能诱入细胞膜的溶质分子其诱入速度也有养 异。一般来讲，分子量小的脂溶性分子可迅速通过细胞膜，如乙醇等有机分 子。有些不带电的极性小分子，如水、尿素等，它们的分子量小、并且为双 极性分子，因而也能穿过细胞膜。一些亲水性的物质，如葡萄糖、氨基酸和 许多无机盐等不易透过细胞膜。 2、实验步骤： ①取一10ml注射器吸取小量肝素将注射器内壁均匀浸湿，并将多余的 肝素去掉，从家兔心脏采集兔血10ml,用生理盐水制成10%的红细胞悬液， 用小烧杯分发到各实验小组（以上步骤由教师完成），兔红细胞悬液为一种 不透明的红色液体，将一本书放到烧杯的背面，隔着烧杯看不清书上的文字。 ②取10支试管放入试管架中，编号，用5ml移液管按顺序分别向管中 加入己配好的试剂各3ml。 1.H02.0.17Mol氯化钠3.0.17Mol氯化铵4.0.17Mol 硝酸钠 5.0.12Mol硫酸钠6.0.12Mol草酸铵7.0.17Mol醋酸铵 8.0.32Mol葡萄糖 9.0.32Mol乙醇10.0.32Mol丙醇 ③用1ml移液管分别向上述试管中加入10%兔红细胞悬液0.3ml,振 摇均匀，注意观察是否发生了红细胞溶血现象。如发生溶血现象，可隔着试 管看清书上的文字。 ④将实验结果记录下表
11 微镜下观察。在高倍镜下可看到许多微小的细胞，即为鸡红细胞；稍大一些 的染成淡兰色的细胞为豚鼠的巨噬细胞。仔细观察可看到巨噬细胞吞噬鸡红 细胞的不同阶段的情况。 （二）红细胞的通透性实验 1、原理：将红细胞置于各种等渗液中，根据细胞膜对各种溶质选择通 透能力的不同，有的溶质分子可透入细胞膜，并使细胞内的盐浓度高于细胞 外，产生渗透压，并使细胞膜胀破，产生溶血现象。而有的溶质分子则不能 通透过细胞膜，红细胞不破裂。能透入细胞膜的溶质分子其透入速度也有差 异。一般来讲，分子量小的脂溶性分子可迅速通过细胞膜，如乙醇等有机分 子。有些不带电的极性小分子，如水、尿素等，它们的分子量小、并且为双 极性分子，因而也能穿过细胞膜。一些亲水性的物质，如葡萄糖、氨基酸和 许多无机盐等不易透过细胞膜。 2、实验步骤： ①取一 10ml 注射器吸取小量肝素将注射器内壁均匀浸湿，并将多余的 肝素去掉，从家兔心脏采集兔血 10ml，用生理盐水制成 10%的红细胞悬液， 用小烧杯分发到各实验小组（以上步骤由教师完成），兔红细胞悬液为一种 不透明的红色液体，将一本书放到烧杯的背面，隔着烧杯看不清书上的文字。 ②取 10 支试管放入试管架中，编号，用 5ml 移液管按顺序分别向管中 加入已配好的试剂各 3ml。 1．H2O 2. 0.17 Mol 氯化钠 3. 0.17 Mol 氯化铵 4. 0.17 Mol 硝酸钠 5. 0.12 Mol 硫酸钠 6 .0.12 Mol 草酸铵 7. 0.17 Mol 醋酸铵 8.0.32 Mol 葡萄糖 9. 0.32 Mol 乙醇 10. 0.32 Mol 丙醇 ③用 1ml 移液管分别向上述试管中加入 10% 兔红细胞悬液 0.3ml，振 摇均匀，注意观察是否发生了红细胞溶血现象。如发生溶血现象，可隔着试 管看清书上的文字。 ④将实验结果记录下表
表2-1实验结果记录表 试管编 试剂种 是否发 类 生溶血 溶血时 结果分析 现象 1 2 4 5 6 7 8 9 10 四、作业与思考题 为什么不同的物质通过细胞膜会有差异，这与细胞膜的结构有何关系？ (李永芳) 6
12 表 2-1 实验结果记录表 试管编 号 试剂种 类 是否发 生溶血 现象 溶血时 间 结 果 分 析 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 四、作业与思考题 为什么不同的物质通过细胞膜会有差异，这与细胞膜的结构有何关系？ （李永芳）
实验五细胞组分的分离和鉴定 一、实验目的 1、理解以细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分的方法。 2、了解细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分的原理及过程。 二、实验用品 (一)材料和标本：小白鼠、冰块。 (二)器材和仪器：玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通 天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10加l 量筒、25l烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、 牙签 (三)试剂：0.25m01/L蔗糖溶液、1%甲苯胺兰染液、0.02%詹纳斯 绿B染液、0.9%NaC1溶液、甲基绿-派罗宁混合染液、 三、实验内容与方法 (一)原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也 不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分 离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮个质中用差 速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种 方法己成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 匀浆(lomogenization):低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗 匀浆介质进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。 分级分离(Fractionation):由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使 较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而 使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密 度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的 第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。 分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能 鉴定。 (二)操作步骤 1、细胞核的分离提取 (1)用颈椎脱白的方法处死取饥饿24小时的小白鼠后，迅速剖开腹部 13
13 实验五 细胞组分的分离和鉴定 一、实验目的 1、理解以细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分的方法。 2、了解细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分的原理及过程。 二、实验用品 （一）材料和标本：小白鼠、冰块。 （二）器材和仪器：玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通 天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml 量筒、25ml 烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、 牙签。 （三）试剂：0.25mol／L 蔗糖溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯 绿 B 染液、0.9％NaCl 溶液、甲基绿-派罗宁混合染液、 三、实验内容与方法 （一）原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也 不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分 离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差 速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种 方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。 匀浆(Homogenization)：低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗 匀浆介质进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。 分级分离(Fractionation)：由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使 较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而 使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密 度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的 第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。 分析：分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能 鉴定。 （二）操作步骤 1、细胞核的分离提取 （1）用颈椎脱臼的方法处死取饥饿 24 小时的小白鼠后，迅速剖开腹部
取出肝脏，剪成小块（去除结缔组织）尽快浸入冰冷的生理盐水(0.9%NaCI), 使组织冷却并洗去血污。 (2)将湿重约1g的肝组织放在小培养皿中，用量筒量取81预冷的 0.25mo1/L蔗糖溶液，先加少量该溶液于培养皿中，尽量剪碎肝组织后 再全部加入。 (3)剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿 中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3~5次，用 3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干 爍。 (4)将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm,离 心15分钟：缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中， 待分离线粒体用：同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥：(3)余下的 沉淀物进行下一步骤。 (5)用6m10.25mol1/L燕糖溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟 弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③， 自然干燥。 (6)晾干的以上三张涂片在95%乙醇中固定5分钟，自然晾干后再用 甲基绿一哌罗宁混合液染色20分钟，水冲洗。用吸水纸吸去多余的水分， 但在徐膜上不可吸的过干，在纯丙铜中分化2一3秒，晾干待镜俭。 分别于高倍镜下观察三张涂片，被染成亮蓝色的为细胞核。分析比较三 张涂片的结果。 2、高速离心分离提取线粒体 (1)将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后， 以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。 (2)加入0.25mo1/L蔗糖溶液1m1,用吸管吹打成悬液，以17000rDm 离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml0.25mol /L蔗糖溶液混匀成悬液（可用牙签）。 (3)取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上（分别标记④， ⑤涂片)，各滴一滴詹纳斯绿B染液盖上盖片染2-3分钟，高倍镜或油镜下 观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成亮绿色。 四、作业与思考 1,简要说明细胞分离的原理及主要先魔 2.比较一下分离细胞核时涂片①、②、③有什么不同？涂片③在你的实 验结果中纯度如何？ 3.描述一下涂片⑤所见结果。 (李永芳常正尧)
14 取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快浸入冰冷的生理盐水（0.9％NaCl）， 使组织冷却并洗去血污。 （2）将湿重约 1g 的肝组织放在小培养皿中，用量筒量取 8ml 预冷的 0.25mol／L 蔗糖溶液，先加少量该溶液于培养皿中，尽量剪碎肝组织后， 再全部加入。 （3）剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿 中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨 3～5 次，用 3 层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干 燥。 （4）将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以 2500rpm，离 心 15 分钟；缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中， 待分离线粒体用；同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的 沉淀物进行下一步骤。 （5）用 6ml0.25mol/L 蔗糖溶液悬浮沉淀物，以 2500rpm 离心 15 分钟 弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③， 自然干燥。 （6）晾干的以上三张涂片在 95％乙醇中固定 5 分钟，自然晾干后再用 甲基绿一哌罗宁混合液染色 20 分钟，水冲洗。用吸水纸吸去多余的水分， 但在涂膜上不可吸的过干，在纯丙酮中分化 2～3 秒，晾干待镜俭。 分别于高倍镜下观察三张涂片，被染成亮蓝色的为细胞核。分析比较三 张涂片的结果。 2、高速离心分离提取线粒体 （1）将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后， 以 17000rpm 离心 20 分钟，弃上清，留取沉淀物。 （2）加入 0．25mol／L 蔗糖溶液 lml，用吸管吹打成悬液，以 17000rpm 离心 20 分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入 0.1ml 0．25mol ／L 蔗糖溶液混匀成悬液(可用牙签)。 （3）取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、 ⑤涂片)，各滴一滴詹纳斯绿 B 染液盖上盖片染 2-3 分钟，高倍镜或油镜下 观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿 B 染成亮绿色。 四、作业与思考 1．简要说明细胞分离的原理及主要步骤。 2．比较一下分离细胞核时涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的实 验结果中纯度如何？ 3．描述一下涂片⑤所见结果。 （李永芳 常正尧）
实验六细胞骨架的显示与观察 一、目的和要求 掌握细胞骨架的光镜临时装片标本的制作方法。 二、实验原理 细胞骨架是指细胞中纵横交错的纤维网络结构，它们是由各种不同成分 的蛋白质组成，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维， 它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重 要作用。 在光镜下观察细胞骨架，通常用非离子去垢剂triton X-l00处理使细 胞膜和胞内的脂类物质被溶解，再用固定剂对细胞骨架进行固定，然后用非 特异性蛋白染料对其进行染色，使胞质中的细胞骨架得以清晰显现。 三、材料和用品 6mM磷酸缓冲液PBS、1%tritonX-100(去垢剂)、3%戊二醛、0.2%考 马斯亮兰R250染料、洋葱。 光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、培养皿、吸水纸、吸管、水浴锅。 四、实验内容与方法 细胞器是构成细胞的基本结构和功能单位。在光镜下，我们只能观察到 线粒体、高尔基体、中心体和细胞核等细胞器的形态。通过特殊处理和染色， 我们也能够看到细胞骨架的基本形态。 实验步骤： 1.取材：撕取洋葱鳞茎内表皮2-3mm2置于载玻片上，用吸管加6mMol PBS缓冲液两滴，使材料充分浸入到液体中，处理5.10分钟。 2.去垢处理：用吸水纸吸净浸泡材料的PBS,加2-3滴去垢剂1%Triton X-100,使液体充分浸泡材料，并立即放入37℃水浴锅中处理15分钟。 3.冲洗：吸去1%Triton,用6 nMol PBS缓冲液轻轻冲洗两次，每次5 分钟 4.固定：用吸管将PBS缓冲液吸尽，加2滴3%戊二醛固定20分钟 5.冲洗：吸去3%戊二醛固定液，用6 nMol PBS缓冲液冲洗两次，每次 5分钟。 6.染色：吸去PBS缓冲液，滴几滴0.2%考马斯亮兰R250染料，染色
15 实验六 细胞骨架的显示与观察 一、目的和要求 掌握细胞骨架的光镜临时装片标本的制作方法。 二、实验原理 细胞骨架是指细胞中纵横交错的纤维网络结构，它们是由各种不同成分 的蛋白质组成，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。 它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重 要作用。 在光镜下观察细胞骨架，通常用非离子去垢剂 triton X-100 处理使细 胞膜和胞内的脂类物质被溶解，再用固定剂对细胞骨架进行固定，然后用非 特异性蛋白染料对其进行染色，使胞质中的细胞骨架得以清晰显现。 三、材料和用品 6mM 磷酸缓冲液 PBS、1% triton X-100（去垢剂）、3%戊二醛、0.2%考 马斯亮兰 R250 染料、洋葱。 光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、培养皿、吸水纸、吸管、水浴锅。 四、实验内容与方法 细胞器是构成细胞的基本结构和功能单位。在光镜下，我们只能观察到 线粒体、高尔基体、中心体和细胞核等细胞器的形态。通过特殊处理和染色， 我们也能够看到细胞骨架的基本形态。 实验步骤： 1.取材：撕取洋葱鳞茎内表皮 2-3mm2 置于载玻片上，用吸管加 6 mMol PBS 缓冲液两滴，使材料充分浸入到液体中，处理 5-10 分钟。 2.去垢处理：用吸水纸吸净浸泡材料的 PBS，加 2-3 滴去垢剂 1%Triton X-100，使液体充分浸泡材料，并立即放入 37℃水浴锅中处理 15 分钟。 3.冲洗：吸去 1%Triton，用 6mMol PBS 缓冲液轻轻冲洗两次，每次 5 分钟。 4.固定：用吸管将 PBS 缓冲液吸尽，加 2 滴 3%戊二醛固定 20 分钟。 5.冲洗：吸去 3%戊二醛固定液，用 6mMol PBS 缓冲液冲洗两次，每次 5 分钟。 6.染色：吸去 PBS 缓冲液，滴几滴 0.2%考马斯亮兰 R250 染料，染色