1.RACE技术 5 AP ·3RACE 是在反转录酶的作用下，以连有可 AP 以和polyA配对的oligo(dT)的锚定 引物启始cDNA第一条链的合成。 ·用RNaseH降解模板mRNA。 ·用通用锚定引物和基因片段内部特 异引物进行PCR扩增得到目的3' GSP1 片段，并可用nest PCR的方法继续 UAP 进行检测和扩增。 GSP2 UAP 6
6 1. RACE技术 • 3’RACE • 是在反转录酶的作用下，以连有可 以和polyA配对的oligo(dT)的锚定 引物启始cDNA第一条链的合成。 • 用RNaseH 降解模板mRNA。 • 用通用锚定引物和基因片段内部特 异引物进行PCR扩增得到目的3’ 片段，并可用nest PCR的方法继续 进行检测和扩增
5.1.2基因扩增 1.聚合酶链式反应 ·聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速 扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极 微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万 乃至千百万倍
7 5.1.2 基因扩增 1. 聚合酶链式反应 • 聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速 扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极 微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万 乃至千百万倍
5.1.2基因扩增 1.聚合酶链式反应 ·基本原理： ·首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链 DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物 中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。新合成的 DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在 模板DNA链两端的退火决定的。DNA解链（变性）、引物与模板 DNA相结合（退火）、DNA合成（延伸）三步，被不断重复。多次 循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位 点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2”。 8
8 5.1.2基因扩增 1. 聚合酶链式反应 • 基本原理： • 首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链 DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物 中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。新合成的 DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在 模板DNA链两端的退火决定的。DNA解链(变性)、引物与模板 DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次 循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位 点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2 n
1.聚合酶链式反应 。 具体过程： -首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（约 94℃)环境下加热1min,使双链DNA变性，形成单链模板 DNA; -然后降低反应温度（约56℃）冷却1min,使引物与两条单 链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端互补序 列位置上； -最后，72℃左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下， 从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→3 方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR 管中进行。反应物加完后，温度由PC℉仪调整，程序完成后 可以拿到产物。 9
9 1. 聚合酶链式反应 • 具体过程： – 首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（约 94℃）环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板 DNA； – 然后降低反应温度（约56℃）冷却1min，使引物与两条单 链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端互补序 列位置上； – 最后，72℃左右保温1至数分钟，在DNA聚合酶的作用下， 从引物的3’-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板按5’→ 3’ 方向延伸，合成新生DNA互补链。以上循环在同一个PCR 管中进行。反应物加完后，温度由PCR仪调整，程序完成后 可以拿到产物
4th cycle wanted gene 3th cycle Exponential amplification 2nd cycle Ist cycle -35th cycle template DNA 22= 23 4 copics 8 copies 16 copies 32 copies 26-68 billion copies (Andy Vierstracte 1999) 多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数 即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高 值是2”。 10
10 多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数， 即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高 值是2 n