《中药生物技术实验》教学大纲一、基本信息中药生物技术实验BK052029课程名称(ExperimentsofChinese课程代码HerbBiotechnology)学科基础专业核「考核方报告课程类型课程性质课心课式学分0.620学时适用对象常规中药资源与开发授课方式开课学院农学院课程负责人宋振巧二、课程简介本课程主要设计了基本组织培养技术为主的实验内容，因为生物技术的绝大部分都要求在无菌条件下进行，组织培养和细胞培养的应用广泛，如药用植物快繁、脱毒培养、花药培养、原生质体和体细胞杂交、农杆菌介导的转基因等，这些均是组培技术为基础。因此该实验涵盖了组培技术的各环节，MS母液和工作液的配置、各种器用品的灭菌、外植体消毒、无菌接种技术、培养技术、快繁技术中实现组织全能性的激素作用实验等内容。三、课程目标要求学生掌握组织培养技术，使学生掌握利用组培技术进行的等方面的应用，以及要求学生掌握遗传转化的原理和技术，使学生掌握药用植物利用转基因进行次生代谢物的生产和重要性状的遗传转化等方面的应用。1.通过本课程的学习，加深对《中药生物技术》基础理论、基本知识的理解，使学生获得生物技术的基本实验技能;2.学生掌握植物组织培养技术，使学生掌握利用组培技术进行具体应用，如快繁、脱毒培养、花药培养等，同时这也是进行转基因的基本环节；3.培养学生理论与实践相结合、综合运用所学知识分析问题和解决问题的能力。四、课程目标对毕业要求的支撑关系毕业要求要求1要求2要求3要求4要求5要求6要求7要求8要求9课程目标VV目标1v1v目标2VVV目标3五、先修课程《中药生物技术实验》是中药资源与开发专业高年级学生的必修专业实验课，之前应先修《分子生物学》，《分子生物学》是该专业课程教学不可分割的一部分，它与课堂教学密切配合，侧重于学生感性认识、动手能力、创新思维意识、实践能力的培养，具有一定的完整性和独立性。六、教学内容3学时实验项目一：MS基本培养基配制及灭菌1.1实验类型：综合设计性实验：1.2实验目的：理解MS各成分的主要作用，掌握MS母液配置的意义和配置；MS工作液配置及其灭菌技术。1.3实验内容：MS母液配置、MS工作液配置、利用灭菌锅对培养基等用品的灭菌（1）MS母液配制方法与步骤?·10倍大量元素母液（1000m1）的配制
《中药生物技术实验》教学大纲 一、基本信息 课程名称 中药生物技术实验 （Experiments of Chinese Herb Biotechnology） 课程代码 BK052029 课程类型 学科基础 课 课程性质 专业核 心课 考核方 式 报告 学 分 0.6 学 时 20 适用对象 中药资源与开发 授课方式 常规 开课学院 农学院 课程负责人 宋振巧 二、课程简介 本课程主要设计了基本组织培养技术为主的实验内容，因为生物技术的绝大部分都要求在无菌条件下进行， 组织培养和细胞培养的应用广泛，如药用植物快繁、脱毒培养、花药培养、原生质体和体细胞杂交、农杆菌介导的 转基因等，这些均是组培技术为基础。因此该实验涵盖了组培技术的各环节，MS母液和工作液的配置、各种器械用 品的灭菌、外植体消毒、无菌接种技术、培养技术、快繁技术中实现组织全能性的激素作用实验等内容。 三、课程目标 要求学生掌握组织培养技术，使学生掌握利用组培技术进行的等方面的应用，以及要求学生掌握遗传转化的原理和 技术，使学生掌握药用植物利用转基因进行次生代谢物的生产和重要性状的遗传转化等方面的应用。 1. 通过本课程的学习，加深对《中药生物技术》基础理论、基本知识的理解，使学生获得生物技术的基本实验技 能； 2.学生掌握植物组织培养技术，使学生掌握利用组培技术进行具体应用，如快繁、脱毒培养、花药培养等，同时这 也是进行转基因的基本环节； 3. 培养学生理论与实践相结合、综合运用所学知识分析问题和解决问题的能力。 四、课程目标对毕业要求的支撑关系 毕业要求 课程目标 要求1 要求2 要求3 要求4 要求5 要求6 要求7 要求8 要求9 目标1 √ √ 目标2 √ √ √ 目标3 √ √ √ 五、先修课程 《中药生物技术实验》是中药资源与开发专业高年级学生的必修专业实验课，之前应先修《分子生物学》，《分子生物 学》是该专业课程教学不可分割的一部分，它与课堂教学密切配合，侧重于学生感性认识、动手能力、创新思维意识、 实践能力的培养，具有一定的完整性和独立性。 六、教学内容 实验项目一：MS基本培养基配制及灭菌 3学时 1.1实验类型：综合设计性实验： 1.2实验目的：理解MS各成分的主要作用，掌握MS母液配置的意义和配置；MS工作液配置及其灭菌技术。 1.3实验内容：MS母液配置、MS工作液配置、利用灭菌锅对培养基等用品的灭菌 （1）MS母液配制方法与步骤 l 10倍大量元素母液（1000ml）的配制
1）称取NH4N0316.5g，KN0319g，放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100m1）溶解；称取KH2P041.7g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100m1）溶解；称取MgS04·7H203.7g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解；称取CaCL2·2H204.4g放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100m1）溶解（也可单独配制成100倍母液）。培养基浓度化合物称取量（g）(mg / L)16.5NH4· N03165019KN031900MgS04·7H203.7370170KH2P041. 7440CaCL·2H204.42）混合：于容量瓶中依次混合上述已溶解的药品；3）定容：加蒸馏水定容至1000ml，即成浓缩10倍的大量元素母液。100倍的微量元素母液（1000m1）的配制1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H3B030.62gMnS04.4H202.23gZnS04·7H200.083gNa2Mo4·2H200.025gCuS04·5H200.0025gCoCL2·6H200.0025g加0.86gKI少量蒸馏水（约600ml）溶解；2）定容：溶解后的上述溶液转入1000ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成100倍的微量元素母液。·100倍的微量元素母液（500m1）的配制1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H3B030. 31 g.MnS04.4H20.1.12 gZnS04·7H200.43gKI0.042gNa2Mo4·2H200.0125g CuS04.5H200.0013gCoCL2·6H200.0013g加少量蒸馏水（约200m1）溶解；2）定容：溶解后的上述溶液转入500ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的微量元素母液。培养基浓度（mg/L）化合物称取量（g）22.3MnS04:4H201.1158.60.43ZnS04·7H20CoCL2·6H200.001250.0250.025CuS04·5H200.00125Na2Mo4·2H200.01250. 25KI0.04150. 83H3B030.316.2@·100倍铁盐母液（500m1）的配制1）称量：称取下列药品，分别放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100m1）溶解；FeS04·7H201.39gNa2-EDTA1.865g2）混合：于500m1烧杯中依次混和两种溶液；3）定容：上述溶液转入500m1的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的铁盐母液。培养基浓度化合物称取量（g）(mg / L)FeS04·7H201. 3927.81.86537.3Na2-EDTA?50倍有机物质母液（500m1）的配制1）称量：电子分析天平称取下列药品，放入烧杯中；肌醇2.5g甘氨酸0.05g烟酸（Vpp）0.0125g盐酸吡哆醇（VB6）0.0025g用少量蒸馏水（约300ml）溶解0.0125g盐酸硫胺素（VB1）2）定容：上述溶液转入500m1的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩50倍的有机物质母液。培养基浓度化合物称取量（g)(mg / L)烟酸（Vpp）0.50.0125盐酸吡哆醇（VB6)0.01250.5
1）称取NH4NO3 16.5g，KNO3 19 g，放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解；称取KH2PO41.7 g放入烧杯中， 用少量蒸馏水（约100ml）溶解；称取MgSO4·7H2O 3.7 g 放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解；称取 CaCL2·2H2O 4.4 g 放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解（也可单独配制成100倍母液）。 化合物 称取量（g） 培养基浓度 （mg∕L） NH4·NO3 16.5 1650 KNO3 19 1900 MgSO4·7H2O 3.7 370 KH2PO4 1.7 170 CaCL·2H2O 4.4 440 2）混合：于容量瓶中依次混合上述已溶解的药品； 3）定容：加蒸馏水定容至1000ml，即成浓缩10倍的大量元素母液。 l 100倍的微量元素母液（1000ml）的配制 1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中，H3BO3 0.62 g MnSO4.4H2O 2.23 g ZnSO4·7H2O 0.86 g KI 0.083 g Na2Mo4·2H2O 0.025 g CuSO4·5H2O 0.0025 g CoCL2·6H2O0.0025 g 加 少量蒸馏水（约600ml）溶解； 2）定容：溶解后的上述溶液转入1000 ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成100倍的微量元素母液。 l 100倍的微量元素母液（500ml）的配制 1）称量：用电子分析天平准确称取下列药品，分别放入烧杯中， H3BO3 0.31 g MnSO4.4H2O 1.12 g ZnSO4·7H2O 0.43 g KI 0.042 g Na2Mo4·2H2O 0.0125 g CuSO4·5H2O 0.0013 g CoCL2·6H2O0.0013 g 加少量蒸馏水（约200ml）溶解； 2）定容：溶解后的上述溶液转入500 ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的微量元素母液。 化合物 称取量（g） 培养基浓度（mg∕L） MnSO4·4H2O 1.115 22.3 ZnSO4·7H2O 0.43 8.6 CoCL2·6H2O 0.00125 0.025 CuSO4·5H2O 0.00125 0.025 Na2Mo4·2H2O 0.0125 0.25 KI 0.0415 0.83 H3BO3 0.31 6.2 l 100倍铁盐母液（500 ml）的配制 1）称量：称取下列药品，分别放入烧杯中，用少量蒸馏水（约100ml）溶解； FeSO4·7H2O 1.39 g Na2-EDTA 1.865 g 2）混合：于500 ml烧杯中依次混和两种溶液； 3）定容：上述溶液转入500 ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩100倍的铁盐母液。 化合物 称取量（g） 培养基浓度 （mg∕L） FeSO4·7H2O 1.39 27.8 Na2-EDTA 1.865 37.3 l 50倍有机物质母液（500 ml）的配制 1）称量：电子分析天平称取下列药品，放入烧杯中；肌醇 2.5 g 甘氨酸 0.05 g 烟酸（Vpp） 0.0125 g 盐 酸吡哆醇（VB6） 0.0125 g 盐酸硫胺素（VB1） 0.0025 g用少量蒸馏水（约300ml）溶解 2）定容：上述溶液转入500 ml的容量瓶，蒸馏水定容，即成浓缩50倍的有机物质母液。 化合物 称取量（g） 培养基浓度 （mg∕L） 烟酸（Vpp） 0.0125 0.5 盐酸吡哆醇（VB6） 0.0125 0.5
0. 1盐酸硫胺素（VB1）0.0025肌醇2.51002甘氨酸0.05·激素类母液的配制1）称量：用电子分析天平准确称取下列激素类药品各0.1g：IBA、NAA、2,4一D；6一BA。2）溶解：生长素类（IBA、NAA、2，4一D）可先用少量0.1mo1/LNaOH或95%酒精溶解：细胞分裂素类（6一BA）可先用0.1mol/L的HCL溶解；3）定容：将上述已溶解的各激素溶液分别加蒸馏水定容至100ml，即成浓缩至1mg/ml的激素类母液。（2）1000mlMS培养基的配制与分装按照母液顺序和所需量，用量筒和专一对应的移液管依次量取下列各母液于容量瓶中：1）10X大量元素母液：100ml；2）100X微量元素母液：10ml；3）100X铁盐母液：10ml；4）50X有机物质母液：20ml：5）加蒸馅水至700ml左右。称取6~10g琼脂和30g蔗糖调pH：用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mo1/LNaOH或0.1mo1/LHCL将其调到5.8左右。（熔化（熬制）：加热煮化。先用旺火烧开，再用文火煮溶。注意经常搅拌，防止糊底和溢出。调pH：待培养基冷却至45℃左右，用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mol/LNaOH或0.1mol/LHCL将其调到5.8左右（或用经验法）。注意：1).培养基适宜PH值5-6.5，一般为5.8，调整用0.1M的NaOH和HC1溶液。2)pH影响培养基的硬度。pH >6.5培养基会变硬，影响营养成分吸收。培养基不易凝固。pH<5.03)灭菌之前，培养基的pH要比标准提高0.2一0.3个单位。分装与扎口：将调好pH值的培养基分装到培养瓶内。每瓶装20～30ml左右的培养基。分装后拧上瓶盖，贴上标签，注明培养基的名称、配制时期，配制人姓名或编号等。每人制备2瓶MS固体培养基，100ml培养基可分装3-4瓶，每组5人，可配制300ml培养基平均分装入10瓶中。每组需准备2瓶无菌水，4盒灭菌滤纸。2、培养基的灭菌1.4教学目标：掌握MS母液配置的意义和配置过程、注意事项；MS工作液配置、理解各成分的主要作用；掌握培养基灭菌技术-高温高压灭菌技术及其灭菌锅的正确使用。3学时实验项目二：药用植物无菌苗获得2.1实验类型：综合设计性实验：2.2实验目的：通过在超净工作台上进行无菌操作验练，使学生初步掌握外植体的消毒处理技术、组织培养的无菌操作技术。2.3实验内容：以决明子（或花生幼胚或丹参种子）为外植体，进行消毒处理和无菌条件下的接种、培养。（1）在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min；（2）正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，20～30min后接种；（3）用肥皂水洗净双手，在缓冲间内穿好灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，进入接种室；（4）用70%-75%的酒精擦拭工作台面和双手；
盐酸硫胺素（VB1） 0.0025 0.1 肌醇 2.5 100 甘氨酸 0.05 2 l 激素类母液的配制 1）称量：用电子分析天平准确称取下列激素类药品各0.1g：IBA、NAA、2,4－D；6－BA。 2）溶解：生长素类（IBA、NAA、2,4－D）可先用少量0.1mol∕LNaOH或95%酒精溶解；细胞分裂素类（6－BA）可先 用0.1mol∕L的 HCL溶解； 3）定容：将上述已溶解的各激素溶液分别加蒸馏水定容至100ml，即成浓缩至1mg∕ml的激素类母液。 （2）1000 ml MS培养基的配制与分装 按照母液顺序和所需量，用量筒和专一对应的移液管依次量取下列各母液于容量瓶中； 1）10X大量元素母液：100ml； 2）100X微量元素母液：10 ml；3）100X铁盐母液：10 ml；4）50X有机物质母液： 20 ml; 5)加蒸馏水至700 ml左右。 称取6～10g琼脂和30g蔗糖 调pH：用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mol∕LNaOH或0.1mol∕L HCL将其调到5.8左右。 （熔化（熬制）：加热煮化。先用旺火烧开，再用文火煮溶。注意经常搅拌，防止糊底和溢出。 调pH：待培养基冷却至45℃左右，用酸度计或pH试纸测试pH值，可用0.1mol∕LNaOH或0.1mol∕L HCL将其调到5.8左 右（或用经验法）。 注意：1).培养基适宜PH值5-6.5，一般为5.8，调整用0.1M的NaOH和HCl溶液 。 2)ｐH影响培养基的硬度。 ｐH ＞6.5 培养基会变硬，影响营养成分吸收。 ｐH ＜5.0 培养基不易凝固。 3)灭菌之前，培养基的ｐH要比标准提高0.2－0.3个单位。 分装与扎口：将调好pH值的培养基分装到培养瓶内。每瓶装20～30ml左右的培养基。分装后拧上瓶盖，贴上标签， 注明培养基的名称、配制时期,配制人姓名或编号等。 每人制备2瓶MS固体培养基，100 ml 培养基可分装3-4瓶，每组5人，可配制300 ml培养基平均分装入10瓶中。每组 需准备2瓶无菌水，4盒灭菌滤纸。 2、培养基的灭菌 1.4教学目标：掌握MS母液配置的意义和配置过程、注意事项；MS工作液配置、理解各成分的主要作用；掌握培养 基灭菌技术-高温高压灭菌技术及其灭菌锅的正确使用。 实验项目二：药用植物无菌苗获得 3学时 2.1实验类型：综合设计性实验： 2.2实验目的：通过在超净工作台上进行无菌操作验练，使学生初步掌握外植体的消毒处理技术、组织培养的无菌 操作技术。 2.3实验内容：以决明子（或花生幼胚或丹参种子）为外植体，进行消毒处理和无菌条件下的接种、培养。 （1）在接种前4h用甲醛与高锰酸钾混合薰蒸接种室，并打开紫外灯照射30min； （2）正式接种前半小时左右，打开超净工作台上的紫外灯和风机，20～30min后接种； （3）用肥皂水洗净双手，在缓冲间内穿好灭过菌的实验服、帽子与拖鞋，进入接种室； （4）用70%-75%的酒精擦拭工作台面和双手；
（5）用蘸有70%-75%酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台；（6）把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上：（7）把植物材料放进70%-75%的酒精中浸泡约30s，再在0.1%的升汞中浸泡5~10min，或在10%的漂白粉上溶液中浸泡10~15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触；然后用无菌水冲洗3~5次；（8）用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶盖；（9）取下接种器械，在火焰上灭菌；（10）把培养材料迅速放入培养瓶，扎上瓶口（每人接种5～10瓶）。操作期间应经常用75%酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上灭菌；（11）接种结束后，清理和关闭超净工作台。每人取18粒表面消毒的的花生胚，在无菌滤纸上切除胚根，切口向下将胚芽接种到MS固体培养基上，每瓶接种8-10个胚芽。培养瓶上贴标签注明姓名、班级和接种日期，放在培养室内培养。接种一周后，观察接种材料的污染情况，并分析污染原因。2.4教学目标：理解外植体含义、外植体取材重要性；掌握外植体的消毒处理技术和无菌接种技术。掌握污染、玻璃化苗出现原因和防止措施、理解激素作用。实验项目三：诱导培养基的配制和灭菌3学时3.1实验类型：综合设计性实验：3.2实验目的：掌握分化培养基基的制备、灭菌。3.3实验内容：设计以无菌苗叶片为外植体，配置用于诱导愈伤分化的培养基、用于分化不定芽的培养基、用于分化生根的培养基，并进行灭菌处理备用。1）、诱导胚性愈伤培养基MSD：MS+10mg/L2,4-D2）、诱导再生不定芽培养基MSB：MS+4mg/LBA+1mg/LNAA3）每人制备1瓶MSD和1瓶MSB培养基，制备方法同实验一。4）准备无菌滤纸和酒精棉球3.4教学目标：为掌握、理解植物激素在植物分化培养的作用准备培养基，掌握生长素和细胞分裂素在分化培养甲作用。3学时实验项目四：激素在植物分化培养的作用4.1实验类型：验证性实验，综合设计性实验：4.2实验目的：理解植物激素在植物分化培养的作用。4.3实验内容：设计以无菌苗叶片为外植体，先后分别接种于诱导愈伤、分化不定芽的培养基，观察各种培养基中材料的生长。（1）超净工作台灭菌：接通电源，打开紫外灯照射20min。同时打开风机20min；（2）人员准备：洗净双手，穿上实验服进入接种室。在超净台内用酒精棉球擦拭双手，台面及接种工具、种苗瓶表面。取空白培养瓶放入超净台内；
（5）用蘸有70%-75%酒精的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台； （6）把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95％酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上； （7）把植物材料放进70%-75%的酒精中浸泡约30s，再在0．1％的升汞中浸泡5～10min，或在10％的漂白粉上溶液 中浸泡10～15min，浸泡时可进行搅动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触；然后用无菌水冲洗3～5次； （8）用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，打开瓶盖； （9）取下接种器械，在火焰上灭菌； （10）把培养材料迅速放入培养瓶，扎上瓶口（每人接种5～10瓶）。操作期间应经常用75％酒精擦拭工作台和双 手；接种器械应反复在95％的酒精中浸泡和在火焰上灭菌； （11）接种结束后，清理和关闭超净工作台。 每人取18粒表面消毒的的花生胚，在无菌滤纸上切除胚根，切口向下将胚芽接种到MS固体培养基上，每瓶接种8-10 个胚芽。培养瓶上贴标签注明姓名、班级和接种日期，放在培养室内培养。接种一周后，观察接种材料的污染情况，并 分析污染原因。 2.4教学目标：理解外植体含义、外植体取材重要性；掌握外植体的消毒处理技术和无菌接种技术。掌握污染、玻 璃化苗出现原因和防止措施、理解激素作用。 实验项目三：诱导培养基的配制和灭菌 3学时 3.1实验类型：综合设计性实验： 3.2实验目的：掌握分化培养基基的制备、灭菌。 3.3实验内容：设计以无菌苗叶片为外植体，配置用于诱导愈伤分化的培养基、用于分化不定芽的培养基、用于分 化生根的培养基，并进行灭菌处理备用。 1）、诱导胚性愈伤培养基MSD：MS+10 mg/L 2,4-D 2）、诱导再生不定芽培养基MSB：MS+4 mg/L BA + 1mg/L NAA 3）每人制备1瓶MSD和1瓶MSB培养基，制备方法同实验一。 4）准备无菌滤纸和酒精棉球 3.4教学目标：为掌握、理解植物激素在植物分化培养的作用准备培养基，掌握生长素和细胞分裂素在分化培养中 作用。 实验项目四：激素在植物分化培养的作用 3学时 4.1实验类型：验证性实验，综合设计性实验： 4.2实验目的：理解植物激素在植物分化培养的作用。 4.3实验内容：设计以无菌苗叶片为外植体，先后分别接种于诱导愈伤、分化不定芽的培养基，观察各种培养基中 材料的生长。 （1）超净工作台灭菌：接通电源，打开紫外灯照射20min。同时打开风机20min； （2）人员准备：洗净双手，穿上实验服进入接种室。在超净台内用酒精棉球擦拭双手，台面及接种工具、种苗瓶 表面。取空白培养瓶放入超净台内；
（3）转接：将酒精灯放在距超净台边缘30cm，正对身体正前方处。将种苗瓶放在灯前偏左处，空白瓶放在灯前处，消毒瓶放在灯右处，以利方便操作；打开原种瓶，将瓶口过火一次，置于一定位置。剪刀和镊子灼烧灭菌后，用镊子将原种瓶内一株试管苗取出，在无菌培养内切取小叶片。打开空白瓶，瓶口过火一次，用过火、冷却的镊子夹住小叶片迅速转接在空白瓶中，每瓶8一10个，接完后瓶口过火封口。以后重复上述动作。（4）每接1瓶后，再用酒精棉球擦拭双手一次，以防交叉感染；（5）接完后，写明标签，移出超净台；（6）转接结束后，将材料放在培养室内培养。3天后检查污染情况，及时清除。4.4教学目标：根据结果，理解各激素及其配比在各种分化培养中作用。实验项目五：农杆菌介导的植物基因转化技术8学时5.1实验类型：验证性实验：5.2实验目的：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理：了解转基因植物筛选的方法。5.3实验内容：·试剂的配制（1）YEB培养基：牛肉膏（5g/L），酵母抽提物（1g/L），蛋白陈（5g/L），蔗糖（5g/L），MgS04（2mmol/L）pH7.2。固体培养基含琼脂15g/L。（2）花生分化培养基：Ms+4mg/L6-BA+1mg/LNAA（3）卡那霉素（Kan）母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，一20℃保存。（4）头孢霉素（Cef））母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，一20℃保存。?·2.农杆菌培养（1）挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在20ml含50mg/LKan的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养过夜。（2）活化过夜的农杆菌按1：50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。（3）5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2Ms液体培养基悬浮至0D600=0.1~0.6，准备感染用。··外植体的侵染及共培养（1）取花生无菌菌叶片，切成46mm的叶盘（或用打孔器制取），叶盘外植体浸入农杆菌菌液（0D600=0.1）中，感染10min，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。（2）将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养3一7天。·4.选择培养将共培养的外植体转移到含500mg/LCef和200mg/LKan的MSB+4.0mg/LBA+1mg/LNAA培养基上继续培养，25℃，光照培养。·继代培养：每隔23周继代一次。·筛选2一3周，统计抗性芽丛（或愈伤）的百分率。5.4教学目标：掌握农杆菌介导途径进行基因转化的机理及操作步骤，根据实验结果，分析影响基因转化效率的因素
（3）转接：将酒精灯放在距超净台边缘30cm，正对身体正前方处。将种苗瓶放在灯前偏左处，空白瓶放在灯前 处，消毒瓶放在灯右处，以利方便操作；打开原种瓶，将瓶口过火一次，置于一定位置。剪刀和镊子灼烧灭菌后，用镊 子将原种瓶内一株试管苗取出，在无菌培养皿内切取小叶片。打开空白瓶，瓶口过火一次，用过火、冷却的镊子夹住小 叶片迅速转接在空白瓶中，每瓶8－10个，接完后瓶口过火封口。以后重复上述动作。 （4）每接1瓶后，再用酒精棉球擦拭双手一次，以防交叉感染； （5）接完后，写明标签，移出超净台； （6）转接结束后，将材料放在培养室内培养。3天后检查污染情况，及时清除。 4.4教学目标：根据结果，理解各激素及其配比在各种分化培养中作用。 实验项目五： 农杆菌介导的植物基因转化技术 8学时 5.1实验类型：验证性实验： 5.2实验目的：掌握根癌农杆菌侵染植物获取转基因材料的方法；理解农杆菌介导途径进行基因转化的机理；了解 转基因植物筛选的方法。 5.3实验内容： l 试剂的配制 （1）YEB培养基：牛肉膏（5g/L），酵母抽提物（1g/L），蛋白胨（5g/L），蔗糖（5g/L），MgSO4（2mmol/L） pH7.2。固体培养基含琼脂15g/L。 （2）花生分化培养基：Ms + 4mg/L 6-BA + 1mg/L NAA （3）卡那霉素（Kan）母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 （4）头孢霉素（Cef））母液：100mg/ml，过滤除菌，分装，－20℃保存。 l 2．农杆菌培养 （1）挑取携带植物表达载体质粒的农杆菌单菌落，接种在20ml含50mg/L Kan的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培 养过夜。 （2）活化过夜的农杆菌按1:50的比例接种在相同的YEB液体培养基中，继续培养至对数生长期。 （3）5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2Ms液体培养基悬浮至OD600=0.1～0.6，准备感染用。 l 外植体的侵染及共培养 （1）取花生无菌菌叶片，切成4～6mm的叶盘（或用打孔器制取），叶盘外植体浸入农杆菌菌液（OD600=0.1）中，感染 10min，取出外植体用无菌滤纸吸去附着的菌液。 （2）将浸染过的外植体接种在分化培养基上，暗培养3－7天。 l 4．选择培养 将共培养的外植体转移到含500mg/L Cef和200mg/L Kan的MSB+4.0mg/L BA＋1mg/L NAA培养基上继续培养, 25℃， 光照培养。 l 继代培养：每隔2～3周继代一次。 l 筛选2－3周，统计抗性芽丛（或愈伤）的百分率。 5.4教学目标：掌握农杆菌介导途径进行基因转化的机理及操作步骤，根据实验结果，分析影响基因转化效率的因 素