(二)质粒DNA的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解 法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒 DNA。这个方法主要包括培养收集细菌 菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体 DNA分开及除去蛋白质和RNA。 1山
11 （二）质粒DNA的制备 有多种分离质粒的方法，如碱裂解 法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒 DNA。这个方法主要包括培养收集细菌 菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体 DNA分开及除去蛋白质和RNA
碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出 的。 在pH值12.0~12.5范圆内时，线性的DNA会 被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。 通过冷却或恢复中性H值使之复性，线性染 色体形成网状结构，而CCCDNA可以准确迅速 复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 CCCDNA的上清液，景后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA。 12
12 碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。 在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会 被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。 通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染 色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速 复性，通过离心去除线性染色体，获得含有 cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质 粒DNA
碱变性法提取质粒的步骤： 1、取1.5毫升含质粒的火肠杆菌过夜培养物，如在 微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的溶液I,(50mM葡萄糖， 25 nM Tris-HCI PH=8.0,10 mM EDTA)涡旋爱 荡悬浮菌液。 3、加入200微升新配制的溶液Il,(0.2 NaOH, 1.06SDS)缓缓混匀置室温5分钟。 4、加入150毫升冰冷的溶液1IIl,(醋酸钾29.4克， 冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升)颇倒离心 管10次后，冰浴5分钟。 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收 集质粒DNA。 13
13 碱变性法提取质粒的步骤： 1、取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在 微量离心管中，离心收集细胞沉淀； 2、加入100微升冰冷的溶液I，（50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA）涡旋震 荡悬浮菌液。 3、加入200微升新配制的溶液II，（0.2M NaOH， 1.0%SDS）缓缓混匀置室温5分钟。 4、加入150毫升冰冷的溶液III，（醋酸钾29.4克， 冰乙酸11.5毫升，加蒸馏水至100毫升）颠倒离心 管10次后，冰浴5分钟。 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收 集质粒DNA
问题： ·1)有些工作者首次进行小量制 备时，有时会发现质粒DNA不 能被限制酶所切割，这几乎总是 由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中 去除所有上清液时注意得不够。 14
14 问题： • １）有些工作者首次进行小量制 备时，有时会发现质粒ＤＮＡ不 能被限制酶所切割，这几乎总是 由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中 去除所有上清液时注意得不够
·大多数情况下，用酚：氯仿对溶 液进行抽提可以去除小量制备物 中的杂质。如果依然存在，可用 离心柱层析法纯化DNA。 15
15 • 大多数情况下，用酚：氯仿对溶 液进行抽提可以去除小量制备物 中的杂质。如果依然存在，可用 离心柱层析法纯化ＤＮＡ