（1）跃迁类型：具有元-元*及n-元*跃迁结构的分子才会产生荧光；(2）共轭效应：共轭度越大，荧光越强：（3）刚性结构：分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高；（4）取代基：给电子取代基增强荧光，吸电子基降低荧光；(5）溶剂效应：溶剂的极性或与溶剂作用改变荧光物质结构都可增加或降低荧光强度；（6）温度：温度升高，荧光强度下降；（7）pH值：不同pH值时，具有酸性或碱性基团的有机物质结构的变化，无机荧光物质稳定性的改变都可影响荧光强度；（8）荧光猝灭：碰撞猝灭、静态猝灭、转入三重态的猝灭、电子转移猝灭、自猝灭。2.叶酸的荧光性能叶酸（Folicacid）是一种广泛存在于绿色蔬菜中的B族维生素，在人体内参与氨基酸及核酸的合成，并能与维生素B2共同促进红细胞的生成。国外研究人员发现，叶酸可引起癌细胞凋亡，对癌细胞的基因表达有一定影响(2-3)。叶酸微溶于水，其钠盐在水中溶解度较大，不过其钠盐溶于水后受光照会分解为噪啶和氨基苯甲酰谷氨酸钠；叶酸在空气中稳定，但受紫外光照射即分解失去活力。其在酸性溶液中对热不稳定，加热易分解，但在中性和碱性环境中比较稳定，100℃下受热1小时也不会被破坏。叶酸稀溶液的荧光比较弱，直接测定灵敏度不高。在浓度为1×10~1×10-mol-L-的水溶液中，叶酸的最大激发光谱为365nm，最强发射峰位于449nm。在入射和出射狭缝均为5nm时，浓度为1×10molL-的叶酸水溶液的激发和发射光谱见图2。Excitation-365nm449nm--Emission茂250300350400450500550600入 / nm图2.叶酸水溶液的激发和发射光谱三实验仪器和材料1.仪器RF-5301PC荧光分光光度计（岛津），电子天平，棕色容量瓶（10mL，8只：50mL，1只）
(1) 跃迁类型：具有 π-π*及 n-π*跃迁结构的分子才会产生荧光； (2) 共轭效应：共轭度越大，荧光越强； (3) 刚性结构：分子刚性越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效 率提高； (4) 取代基：给电子取代基增强荧光，吸电子基降低荧光； (5) 溶剂效应：溶剂的极性或与溶剂作用改变荧光物质结构都可增加或降低荧光强度； (6) 温度：温度升高，荧光强度下降； (7) pH 值：不同 pH 值时，具有酸性或碱性基团的有机物质结构的变化，无机荧光物质稳定 性的改变都可影响荧光强度； (8) 荧光猝灭：碰撞猝灭、静态猝灭、转入三重态的猝灭、电子转移猝灭、自猝灭。 2. 叶酸的荧光性能 叶酸（Folic acid）是一种广泛存在于绿色蔬菜中的 B 族维生素，在人体内参与氨基酸及核酸 的合成，并能与维生素 B12共同促进红细胞的生成。国外研究人员发现，叶酸可引起癌细胞凋亡， 对癌细胞的基因表达有一定影响 [2-3]。叶酸微溶于水，其钠盐在水中溶解度较大，不过其钠盐溶 于水后受光照会分解为喋啶和氨基苯甲酰谷氨酸钠；叶酸在空气中稳定，但受紫外光照射即分解 失去活力。其在酸性溶液中对热不稳定，加热易分解，但在中性和碱性环境中比较稳定，100℃下 受热 1 小时也不会被破坏。 叶酸稀溶液的荧光比较弱，直接测定灵敏度不高。在浓度为 1×10-4~1×10-5 mol·L-1的水溶液 中，叶酸的最大激发光谱为 365nm，最强发射峰位于 449nm。在入射和出射狭缝均为 5nm 时，浓 度为 1×10-4 mol·L-1 的叶酸水溶液的激发和发射光谱见图 2。 250 300 350 400 450 500 550 600 Excitation Emission I λ / nm 365nm 449nm 图 2. 叶酸水溶液的激发和发射光谱 三 实验仪器和材料 1. 仪器 RF-5301PC 荧光分光光度计（岛津），电子天平，棕色容量瓶（10mL，8 只；50mL，1 只）
棕色玻璃瓶（1000mL，2只），烧杯（1000mL，2只：500mL，1只：100mL，1只），移液管（5mL4支），一次性滴管，称量纸，药匙（4把）。2. 试剂叶酸标准品（BR），氢氧化钠（AR），医用叶酸片（1瓶）。四、仪器功能及使用介绍1.仪器功能(1）可用作鉴定：利用激发光谱和荧光光谱可进行样品的鉴定及推测杂质的存在与否。（2）可用作定量分析：不发生浓度猝灭（试样浓度高而荧光强度反倒降低的现象）的稀溶液，其荧光强度和物质的浓度成比例。(3）解析分子间相互作用：从荧光光谱中求出的荧光发射峰的波长、荧光强度（量子产率）、荧光寿命，可推测物质所吸收的光能经过的途径，并且通过考察这些结果与试样浓度的关系及共存物质的影响，可解析分子间的相互作用。2.标准曲线法配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。具体测试步骤为：1）打开电脑和RF-5301系统的开关，点击桌面的RF-5301的快捷图标，启动仪器的控制程序。（2）从“AcquireMode”菜单中选[Spectrum光谱，进入光谱模式。（3）从“Configure设置”菜单中选择[Parameters参数]Speetrnm.FarmrtrwX要测试的光谱炎型Spectrun Iype:Exitaltiun CEintuotonCSyudirunuus选择测量激发波长[447InmCM Wavelength:设置发射220Ex Wgvelength Nangc:StertEnd500波长值荧光弱度Ngcording Nange:Low0.0001000.000Hiyh范围打描激发Super司Scanning Speed:波长范围打描速度国0Samafing laterval [nm):1.0Sit Width [nm:FXFM15-5扫描问隔设置狭缝宽CtlighG LoWSeasltivity:口灵敏度Ncapanse Timc [scc):Aulu反应时间Bepeat SeanAuto Fife...OKCancel（4）若样品激发光谱的发射波长或发射光谱的激发波长未知，则在上述对话框中设置合适的激发发射狭缝宽度，灵敏度，放置标样，在光度计按键中点击Searcha在弹出的对话框中选择激发光和发射光的范围以及激发光的波长的间隔，点“Search”键，等待一段时间，由仪器给出最优波长。（5）扫描完成后出现的谱图
棕色玻璃瓶（1000mL，2 只），烧杯（1000mL，2 只；500mL，1 只；100mL，1 只），移液管（5mL， 4 支），一次性滴管，称量纸，药匙（4 把）。 2. 试剂 叶酸标准品（BR），氢氧化钠（AR），医用叶酸片（1 瓶）。 四、仪器功能及使用介绍 1.仪器功能 (1) 可用作鉴定：利用激发光谱和荧光光谱可进行样品的鉴定及推测杂质的存在与否。 (2) 可用作定量分析：不发生浓度猝灭（试样浓度高而荧光强度反倒降低的现象）的稀溶液， 其荧光强度和物质的浓度成比例。 (3) 解析分子间相互作用：从荧光光谱中求出的荧光发射峰的波长、荧光强度（量子产率）、 荧光寿命，可推测物质所吸收的光能经过的途径，并且通过考察这些结果与试样浓度的关系及共 存物质的影响，可解析分子间的相互作用。 2. 标准曲线法 配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知样的荧光 强度，在标准曲线上求出浓度。具体测试步骤为： （1）打开电脑和 RF-5301 系统的开关，点击桌面的 RF-5301 的快捷图标，启动仪器的控制程 序。 （2）从“Acquire Mode”菜单中选[Spectrum 光谱]，进入光谱模式。 （3）从“Configure 设置”菜单中选择[Parameters 参数] （4）若样品激发光谱的发射波长或发射光谱的激发波长未知，则在上述对话框中设置合适的 激发发射狭缝宽度，灵敏度，放置标样，在光度计按键中点击 ，在弹出的对话框中选择 激发光和发射光的范围以及激发光的波长的间隔，点“Search”键，等待一段时间，由仪器给出 最优波长。 （5）扫描完成后出现的谱图
93.89780.00000.000sua40.00020.000-0.9993500annn（6）定量分析的参数设置。菜单栏中选择“AcquireMode”“Quantitative”进入定量模式，选择“Configure”“Parameters”，在弹出的参数对话框中选择方法，激发发射光波长，激发发射狭缝宽度，灵敏度，反应时间，单位，浓度以及强度范围。Quantitative ParanctersConcentrationMethod:ppbMultipointWorking CurveUnits:Range:0.000100.000353.0toEXWavelength:450.0EM Wavelength:Recording Range5SlitWidth(nm):EX-0.0001000.000HighLowEM5A·HighCLowAutoMSensitivity:Response Iime:一Auto Scan Mode1Bepetitions:CancelOK点击“Method”下拉菜单中，选择“MultipointWorkingCurve”后，弹出如下对话框，ultipoint Forking Curve1stC2ndC 3rdOrder of CurveoYesCNoZero InterceptionOKCancel选择工作曲线的次数，是否过原点（此处为1次，过原点），点击“OK”（7）将第一个标准样品装入池槽中，在光度计按键中点击Standard进入标准曲线制作界面如下：
（6）定量分析的参数设置。 菜单栏中选择“Acquire Mode”、“Quantitative”进入定量模式，选择“Configure”、 “Parameters”，在弹出的参数对话框中选择方法，激发发射光波长，激发发射狭缝宽度，灵敏 度，反应时间，单位，浓度以及强度范围。 点击“Method”下拉菜单中，选择“Multipoint Working Curve”后，弹出如下对话框， 选择工作曲线的次数，是否过原点（此处为 1 次，过原点），点击“OK”。 （7）将第一个标准样品装入池槽中，在光度计按键中点击 ，进入标准曲线制作界 面如下：
ORF-5301PO口回区EilebeeuireBodeCanfigureManipdlataPresentationBalStandor1000.000StandardConc.Int.Munber500.0000-00.00050:00100.0002opthInlAtEX:3530EM:45001015.798KeLamp:ON0.00[国放入空白溶剂即蒸馏水，点击AutoZeroRead放入标准样品，点击弹出如下“Edit”对话框，以此测完7个标准样品后，屏幕上会出现工作曲线，也会出现标准曲线方程。输入标准样品浓度，点击“OK”。Edit1Standard Number12.5Concentration14.949Int.OKCancelDelete（8）以此测完7个标准样品后，软件显示工作曲线并给出曲线方程（勾选“Presentation”、“DisplayEquation”可见）
放入空白溶剂即蒸馏水，点击 ，放入标准样品，点击 ，弹出如下“Edit” 对话框，以此测完 7 个标准样品后，屏幕上会出现工作曲线，也会出现标准曲线方程。输入标准 样品浓度，点击“OK”。 （8） 以此测完 7 个标准样品后，软件显示工作曲线并给出曲线方程（勾选“Presentation”、 “Display Equation”可见）
URF-6301PC口回区EinobegoireMoleContiprenipditeEresntatisn FalySAAT100.0standardtat.Conc.Munbe29-9929.62500.00100.0000500Conc=0.840XIntr-Square: 0.99987食tdo.CeenD:353.0EM:450.057.96？（9）在工作曲线绘制完成后，可以定量测定未知样的浓度，点击Unknown将未知样品放自自入池槽中，点击Bead开始浓度的测定。EJRF-5301PC口区区EileAequireModeConfigreMunipalateEreseatstionBelyUnknown1000.000Seq-SanpleTDconcInt.92.62338.883500.0000.011Sele :Conc 0.840XIntr-Square: 0.99987?国国FX3530EM400
（9）在工作曲线绘制完成后，可以定量测定未知样的浓度，点击 ，将未知样品放 入池槽中，点击 开始浓度的测定