实验二十一叶绿素的定量测定 一、原理 根据叶绿套对可见光的吸收光谱，利用分光光度计在某一特定波长下测定其光密度， 而后用公式计算叶绿素含量。 根据比尔定律，某有色溶液之光密度D应与其浓度C成比例，即： D=KC 式中，K为比例常数，当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1厘米时，K为该物 质的比吸收系数。 如欲测定叶绿体色素混合提取液（包括叶绿素a、b、叶黄素、胡萝卜素）中叶绿素a、b 的含量，只需测定该提取液在某一特定波长下的光密度D,并根据叶绿素a、b在该波长下 的比吸收系数即可求出两种叶绿素各自的浓度。为了排除黄色素干扰，所用单色光应选 择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a,b在红光区的最大吸收峰分别位于663纳米和645纳米；又已知在波 长663纳米下，叶绿素a、b的80%丙酮溶液的比吸收系数分别为82.04和9.27。在波长 645纳米下分别为16.75和45.60，可据此列出下列关系式： D63=82.04Ca+9.27C公式 (1) D4=16.75Ca+45.6C6公式 (2) 式(1)、(2)中的D63和D65为叶绿素溶液在波长663纳米和645纳米时的光密度， C,C,分别为叶绿素a和b的浓度。 解方程组(1)、(2)并转换成毫克·升-1单位得 Ca=12.7Dw-2.59D4s ) Cb=22.9D645-4.67D6s (4 将C与C相加，即得叶绿素总量Cr Cr=C,+C=20.3D64s+8.03D6 (5) 另外，由于叶绿素a、b在652纳米处有相同的比吸收系数（均为34.5），也可以在此 波长下测定一次光度(D62)而求出叶绿素总量： Cm(毫克升-1)=×1000 34.5 (6) 二、试验材料、仪器和试剂 (一)仪器 ·175·
1.分光光度计：1台：2.研姊：1个3.量简：一个；4.剪刀：1把；5.50毫升量瓶1个6， 玻棒：7.4厘米漏斗1个；8.7厘米滤纸1张：9.滴管1支。 (二)试剂 80%丙酮 (三)材料 任何欲测的植物器官。 三、操作步骤 1.取样、剪碎、混匀，然后称取新鲜样品0.5g。 2.样品置研钵中，加少量碳酸钙和石英砂及3毫升纯丙酮研成匀浆，再加80%丙酮 10毫升继续研磨至组织变为白色。 3.取滤纸一张，放入漏斗中用80%丙酮湿润，把提取液倒人漏斗中，滤人50毫升量 瓶里，用少量丙酮冲洗研体数次，最后连残渣一起倒人漏斗。 4,用滴管吸取80%丙酮，一滴一滴的将滤纸上的叶绿素提取液全部洗人量瓶内，直 到滤纸和残渣中无绿色止。最后用80%丙酮定容至50毫升。 5.把叶绿素提取液倒人光径1厘米的比色杯内，用分光光度计分别在波长645、652 和663纳米下测定光密度，以80%丙酮为空白对照。 6.按公式(3)、(4)分别计算叶绿素a、b的浓度（毫克升），相加即得总浓度，亦可按公 式(6)直接计算叶绿素总浓度 7求得叶绿素浓度后再按下式计算叶片的叶绿素含量 叶绿素合量（鲜重%）-C(毫克/升)×提取被总意（毫升）×100 样品鲜重（毫克）×1000 四、注意事项 1.为了避免叶绿素的光分解，操作应在弱光下进行。研磨时间应尽可能短些，以不超 过2分钟为宜。 2.用分光光度法测定叶绿素含量，对分光光度计本身的精确性要求较高，分光光度计 在使用前需对波长进行校正。校正的方法除按仪器说明校正外，还应以纯的叶绿素a和 b来校正。因为即使用国产仪器中性能较好的751型分光光度计，经校正后在600~700 纳米波段中的读数误差还可能有±2纳米，这对测定叶绿素a:b值已有影响。 176
实验二十五植物体内抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶的测定 一、原理 1.抗环血酸氧化酶在有氧情况下，能氧化抗坏血酸成脱氢抗坏血酸，同时促使其氢与 空气中的氧结合成水。 抗坏血酸氧化酶的测定是在该酸的最适pH及适直的温度下，向反应瓶中加人一定 量的底物（抗坏血酸）及酶提取液，让酶作用一段时间，然后测定底物被消耗的数量来计算 降的活性。 OH +0年化 0 OHC-H OH C-H CH2OH 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 抗坏血酸被消耗的量，则可用胰液滴定剩余的抗坏血酸而测定之。 K1O3+5KI+6HPO3→32+6KP03++3H0 0 +2HΠ OH C-H OH- CH2OH CH2OH 抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 2.多酚氧化聘在氧的存在下，可将多酚类物质氧化为相应的醌；醒又能进一步氧化抗 坏血酸。 ·185·
OH- HO- OH- CH2OH CH2OH 邻 脱氢抗坏血酸 邻苯二酚 抗坏血酸 这种氧化还原关系是由于酚类物质与抗坏血酸之间的氧化还原电位差异而决定的。 酚类物质比抗坏血酸的氧化不原电位高；因而邻醇能夺取抗坏血酸上的氢，使自身得以还 原。因此，多酚氧化酶的测定与抗坏血酸氧化酶的测定类似，除了向反应体系中加人多酚 氧化酶的底物一多元酚类，还要如入抗环血酸。多酚氧化酶的活性，可以间接由抗坏血酸 的消耗量求得。 二、实验材料、仪翳和试剂 (一)仪器 1.研体一个： 2.50毫升量瓶一个；3.50毫升三角瓶6个；4.微量滴定 管1支；漏斗、吸耳球、滤纸5.5毫升移液管1支、2毫升2支、1毫升2支： 6.恒温水裕。 (仁)试剂 1.pH6.0的碘酸盐缓冲液；A液为115M磷酸氢二钠溶液；B液为115M醉酸二氢 钾溶液，取A液10毫升与B液90毫升混匀即可。 2.0.1%抗坏血酸，实验当天配制。 3.0.02M焦儿茶酚：称取0.22克焦儿茶酚溶于100毫升水中，实验当天配制。 4.10%偏磷酸 5.1%淀粉溶液。 6.0.005N碘液：碘化钾2.5克溶于200毫升蒸瘤水中，加冰酷酸1毫升，再加0.1N 碘酸钾(0.3567克澳酸钾溶于水，定裕至100毫升)12.5毫长，最后加蒸馏水成250毫 ·186·
(三)材料 马铃薯块茎、甘薯块根、植物叶片。 三、操作步骤 1.碑液提取：称取新鲜样品（叶子用2克，马铃薯块茎用4克）剪碎置研体中，加少量 石英及p6.0的碑酸盐缓冲液，迅速研磨成匀浆（事先将缓冲液用冰水冷却，不使研磨时 温度增高)。把全部材料用缓冲液洗人50毫升量瓶中，并用缓冲液定容至刻度。放在18 20℃水浴上浸提30分钟，中间摇动数次。将上清液（酶浸提液）倾人干净的三角瓶中备 用。 2.酶活性的测定：取6个50毫升洗净干燥的三角瓶，标上号码。 按下表先在各瓶中加缓冲液、抗坏血酸及焦儿茶酚：并向3及6号瓶加人1毫升偏深 酸。将三角瓶放人18~20℃水浴中，使内外温度平衡。每隔2分钟向各瓶中依次加人酶 液2毫升，准确记录加人酶液的时间。将各瓶在18一20℃水浴中保温3分钟后，立即按 原次序向1、2、4、5、号瓶各加入偏磷酸1毫升，以终止酶的活动。待反应瓶冷却后，各加 淀粉溶液3滴作指示剂，用微量滴定管以0.005N碘液进行滴定至出现浅蓝色为止。记 录滴定值。 、试剂（熹米 蒸馏水抗环血酸焦儿茶酚酶溶液偏磷酸备 注 瓶 4 2 2 测抗坏血酸氧化酶 2 4 2 2 同上 3 4 2 2 1 空白测定 4 3 2 测定抗坏血酸氧化酶 及多酚氧化酶 5 3 2 2 同上 6 321 2 1空白测定 3.酶活性的计算：酶活性以每克鲜组织每分钟氧化抗坏血酸的毫克数表示。计算方 法如下： (1)抗坏血酸氧化酶活性按下式计算； 抗坏血酸氧化酶活性（氧化抗环血酸毫克数.克鲜重1，分） 187