二、PCR技术的特点 ()高度的敏感性 PCR产物的生成是以指数方式增加的,即使按75%的 扩增效率计算,单拷贝基因经25次循环后,其基因拷贝数 也在100万以上,即可将极微量(pg级)DNA扩增到紫外光 下可见的水平(μg级)。 高度的特异性 PCR扩增的特异性在很大程度上依赖于引物与模板的 互补程度,即引物与模板结合的正确性。 白操作简便、快速 四适用样品广泛 含微量(pg、ng)目的DNA或RNA的样品即可用作反应 的起始材料
二、PCR技术的特点 ㈠ 高度的敏感性 PCR产物的生成是以指数方式增加的，即使按75%的 扩增效率计算，单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数 也在100万以上，即可将极微量(pg级)DNA扩增到紫外光 下可见的水平(g级)。 ㈡ 高度的特异性 PCR扩增的特异性在很大程度上依赖于引物与模板的 互补程度，即引物与模板结合的正确性。 ㈢ 操作简便、快速 ㈣ 适用样品广泛 含微量(pg、ng)目的DNA或RNA的样品即可用作反应 的起始材料
常规的PCR操作 ()反应体系 标准PCR反应体积为50-100ul,其中含有:1XPCR 反应缓冲液、四种dNTP(dATP、dCTP、dGTP dTTP)、二种上、下游引物、DNA模板、 Taq dna聚合 酶 (=反应步骤 四、PCR反应条件的优化 ()模板核酸 PCR可以用DNA或RNA模板材料。但用RNA模板的 扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环
三、常规的PCR操作 ㈠ 反应体系 标准PCR反应体积为50~100l，其中含有：1PCR 反应缓冲液、四种 dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP 、 dTTP)、二种上、下游引物、DNA模板、Taq DNA聚合 酶。 ㈡ 反应步骤 四、PCR反应条件的优化 ㈠ 模板核酸 PCR可以用DNA或RNA模板材料。但用RNA模板的 扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环
(引物 引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸, 两段引物分别与相应的一条DNA链3端及5端互补。 引物设计一般遵循下列原则: (1)引物的序列应选定基因组DNA的高度保守区,以减少 引物与基因组的非特异结合,提高反应的特异性 (2)引物的长度以1540bp为宜 (3)引物的碱基尽可能随机分布,避免出现数个嘌呤或嘧 啶的连续排列,G+C碱基的含量在40%75%之间。 (4)引物内部应避免形成二级结构,特别是引物的未端应 无回文结构
㈡ 引物 引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸， 两段引物分别与相应的一条DNA链3’端及5’端互补。 引物设计一般遵循下列原则： (1) 引物的序列应选定基因组DNA的高度保守区，以减少 引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。 (2) 引物的长度以15~40bp为宜。 (3) 引物的碱基尽可能随机分布，避免出现数个嘌呤或嘧 啶的连续排列，G+C碱基的含量在40%~75%之间。 (4) 引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应 无回文结构
5)二个引物之间不应有互补序列,以免形成“引物二聚 体”,浪费引物。 (6)引物5‘末端碱基无严格限制,在与模板结合的引物长 度足够的条件下,其5端碱基互补程度无严格限制。 (7)引物3端的头1~2个碱基会影响 Taq dna聚合酶的延 伸效率,从而影响PCR反应的扩增效率及特异性,因此选 择合适的3端碱基很重要。最好选T、C、G,不选A (8)引物的3端应为保守氨基酸序列,即采用简并密码少 的氨基酸如Met、Trp,且要避免三联体密码第3个碱基的 摆动位置位于引物的3'末端
(5) 二个引物之间不应有互补序列，以免形成“引物二聚 体” ，浪费引物。 (6) 引物5′末端碱基无严格限制，在与模板结合的引物长 度足够的条件下，其5′端碱基互补程度无严格限制。 (7) 引物3′端的头1~2个碱基会影响Taq DNA聚合酶的延 伸效率，从而影响PCR反应的扩增效率及特异性，因此选 择合适的3′端碱基很重要。最好选T、C、G，不选A (8) 引物的3′端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少 的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第3个碱基的 摆动位置位于引物的3′末端