(a) 基因组DNA 杂交步骤： 1.酶切 DNA限制片段段 2.电泳（变性） 意有EBr染料 的琼指凝胶 3.转膜（注意 基因组DNA (b) 标准分子量DNA DNA要小于2kb) 重物 玻璃板 4.封闭 吸号速纸 凝胶 (c) 5.杂交 高盐缓冲液 6.显影 (d) 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的基因 DNA片段 (e) X光底片
26 （a） （b） （c） （d） （e） 基因组DNA DNA限制片段 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的基因 DNA片段 X光底片 杂交步骤： 1.酶切 2.电泳(变性） 3.转膜(注意 DNA要小于2kb） 4.封闭 5.杂交 6.显影
核酸杂交常用几种膜的性能比较 类 型 优点 缺点 硝酸纤维素滤膜 结合ssDNA,RNA和蛋白质的能力为 易碎、易皱缩；不能同DNA共价结合， 80~1004g/cm2,价廉，可用于微量制备 因此再使用能力有限；在10×SSC缓冲液中 结合能力下降，要用特殊的程序才能结合 RNA或小片段DNA DBM/DPT滤纸 结合ssDNA、RNA和蛋白质的能力为 杂交作用没有硝酸纤维素滤膜有效；需 20~40g/cm2;能同核酸及蛋白质分子共价 要化学激活；时间、温度和pH值等因素不 稳定地结合；可以用不同的探针进行成功的 稳定性：价格昂贵 检验 DEAE滤纸 结合dsDNA,RNA的能力为15g 结合DNA、RNA的能力有限；易碎 cm2,可定量地回收DNA Nylon(尼龙)滤膜 结合DNA,RNA和蛋白质；检测敏感 有些类型会出现较高的本底 性高；柔性好；抗热抗溶解作用；不需要预浸 湿 27
27 核酸杂交常用几种膜的性能比较
A BC D E F GHI JK L Kb 8.5 5.0 22 Southern DNA印迹杂交之X光显像图片 水稻(Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限 制酶BglⅡ(A-C)、BamH I(D-F)、EcoR I(G-I)、和 HindI(JL)消化，加样在含有EB染料的1%的琼脂糖凝胶 电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作 Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻 的psbA基因序列。 28
28 Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限 制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和 HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EB染料的1%的琼脂糖凝胶 电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作 Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻 的psbA基因序列
三、Northern杂交 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是 将NA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤 膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核 酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与 Southernl印迹杂交技术十分类似，所以叫 做Northern印迹技术(Northern blotting) 。 29
29 三、Northern杂交 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是 将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤 膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核 酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与 Southern印迹杂交技术十分类似，所以叫 做Northern印迹技术（Northern blotting）
Southern杂交和Northern杂交的主要差别： 1.对象不同(DNA/RNA) 2.DNA在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形 成单链。 RNA一般是进行变性电泳，在分离RNA 的同时消除二级结构。 RNA变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、 羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种。 30
30 Southern杂交和Northern杂交的主要差别： 1.对象不同（DNA/RNA） 2.DNA在凝胶电泳分离后，用碱处理变性，形 成单链。 RNA一般是进行变性电泳，在分离RNA 的同时消除二级结构。 RNA变性电泳方法主要有甲醛变性电泳、 羧甲基变性电泳和乙二醛变性电泳三种