一、探针与探针标记 0 杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序 列，而为了达到这一目的，必需要有标记 的探针。 ·带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。 ·使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程 叫探针标记。 21
21 一、探针与探针标记 • 杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序 列，而为了达到这一目的，必需要有标记 的探针。 • 带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。 • 使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程 叫探针标记
1.切口平移标记 ·用一定浓度的DNasel在双链DNA的一条链 的有限位置上打开切口。 利用DNA聚合酶的5→3的核酸外切酶活 。1 性将DNA一条链上的核苷酸一个一个的切 除，同时暴露出另一条单链DNA。 。 以这条单链DNA为模板，利用DNA聚合酶！ 的5'→3'的DNA聚合功能把一个一个带有 标记的dNTP合成上去。 22
22 1.切口平移标记 • 用一定浓度的DNaseI在双链DNA的一条链 的有限位置上打开切口。 • 利用DNA聚合酶I的5’ →3’的核酸外切酶活 性将DNA一条链上的核苷酸一个一个的切 除，同时暴露出另一条单链DNA。 • 以这条单链DNA为模板，利用DNA聚合酶I 的5’ →3’的DNA聚合功能把一个一个带有 标记的dNTP合成上去
大肠杆菌聚合酶的应用示例 缺口转移制备探针 PolI+Mg2++a -32P]dNTPs 2323
2323 大肠杆菌聚合酶I的应用示例 缺口转移制备探针 Pol I + Mg2++［α－32P］ dNTPs
2.随机引物标记 。f 能与任何DNA模板的多个位点配对互补的 多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫随 机引物。 o DNA聚合酶Klenow大片段能在随机物的 引导下以带有标记的dNTP为原料合成新的 与模板DNA互补的探针。 24
24 2.随机引物标记 • 能与任何DNA模板的多个位点配对互补的 多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段叫随 机引物。 • DNA聚合酶Klenow大片段能在随机引物的 引导下以带有标记的dNTP为原料合成新的 与模板DNA互补的探针
二、Southern,杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝 胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤 膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探 针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段， 这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于 它是由E.Southern于1975年首先设计出来 的，故又叫Southern DNA印迹转移技术。 25
25 二、Southern杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝 胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤 膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探 针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段， 这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于 它是由E.Southern于1975年首先设计出来 的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术