表7-2-12正交实验水平、方案及结果 试验号蛋白胨淀粉 酵母膏X(MTG酶活/mL)xi2 l(15g/L)1(20g/D)l(1gL)0.82 0.672 2(20g/L)2(25g/)2(2g/L)1.85 3(25g/L)3(30g/D)3(3g/L)1.19 7 4.32 ∑x ∑x2=21356 5.11 5.39 5.07 3.37 4.49 极差 2.18 0.12 K12 18.66 26.11 1945 K32 ∑K2610660305827 表7-2-13正交实验方差分析 误差来源平方和自由度方差F显著性 蛋白胨934204672883* 淀粉 0.681 0.3412.102 酵母膏0.0048 0.00240.0148 误差 0.32420.162 总和 1.944 1.88 由方差分析可知,蛋白胨以及淀粉的浓度变化对MIG发酵都有显著的影响。从表 7-2-12的直观分析及表7-2-13的F值可以看出,三因素对MIG发酵影响的显著性主次顺 序为:蛋白胨>淀粉>酵母膏。因此,蛋白胨及淀粉的最适浓度分别为20g/和25gL,酵 母膏对菌体生长以及产酶影响不太显著,可选择实验范围内的任意一点,考虑成本问题选 择酵母膏浓度2g/L 实验得出适宜的MTG摇瓶发酵培养基组成为(g/L):蛋白胨20,淀粉25,酵母膏2, 无水硫酸镁2,磷酸氢二钾2,磷酸二氢钾2。 五、MIG合成的摇瓶发酵过程分析 为了全面了解MIG摇瓶发酵过程中基质消耗、菌体生长、产物形成等各参数的变化 情况,根据正交实验得到的优化结果进行实验,得到发酵过程曲线(图7-2-2)。发酵过程中 氨基酸的变化示于图7-2-3。可以发现,游离氨基酸在中后期MIG的合成中起着十分重要 的作用,MrG酶的交联是造成培养基中游离氨基酸浓度的迅速缺乏的原因之一,而游离 氨基酸的缺乏又会影响MIG酶的合成。为从根本上提高发酵水平,应对MTG合成的机
11 表 7-2-12 正交实验水平、方案及结果 试验号 蛋白胨 淀粉 酵母膏 Xi(MTG 酶活/umL-1 ) Xi2 1 1(15 g/L) 1(20 g/L) 1(1 g/L) 0.82 0.672 2 2(20 g/L) 2(25 g/L) 2(2 g/L) 1.85 3.28 3 3(25 g/L) 3(30 g/L) 3(3 g/L) 1.19 1.44 4 1 2 3 1.29 1.66 5 2 1 3 2.01 3.92 6 2 3 1 1.25 1.49 7 3 2 1 2.25 5.34 8 3 1 2 1.63 2.66 9 1 3 2 0.93 0.90 K1 3.04 4.46 4.32 i x =13.08 = 2 i x 21.36 K2 5.11 5.39 4.41 K3 5.07 3.37 4.49 极差 2.18 2.04 0.12 K12 9.24 19.89 18.66 K22 26.11 29.05 19.45 K32 25.70 11.36 20.16 2 Ki 61.06 60.30 58.27 表 7-2-13 正交实验方差分析 误差来源 平方和 自由度 方差 F 显著性 蛋白胨 0.934 2 0.467 2.883 * 淀粉 0.681 2 0.341 2.102 * 酵母膏 0.0048 2 0.0024 0.0148 误差 0.324 2 0.162 总和 1.944 8 F0.25(2,2)=1.88 由方差分析可知，蛋白胨以及淀粉的浓度变化对 MTG 发酵都有显著的影响。从表 7-2-12 的直观分析及表 7-2-13 的 F 值可以看出，三因素对 MTG 发酵影响的显著性主次顺 序为：蛋白胨>淀粉>酵母膏。因此，蛋白胨及淀粉的最适浓度分别为 20 g/L 和 25 g/L，酵 母膏对菌体生长以及产酶影响不太显著，可选择实验范围内的任意一点，考虑成本问题选 择酵母膏浓度 2 g/L。 实验得出适宜的 MTG 摇瓶发酵培养基组成为(g/L)∶蛋白胨 20，淀粉 25，酵母膏 2， 无水硫酸镁 2，磷酸氢二钾 2，磷酸二氢钾 2。 五、MTG 合成的摇瓶发酵过程分析 为了全面了解 MTG 摇瓶发酵过程中基质消耗、菌体生长、产物形成等各参数的变化 情况，根据正交实验得到的优化结果进行实验，得到发酵过程曲线(图 7-2-2)。发酵过程中 氨基酸的变化示于图 7-2-3。可以发现，游离氨基酸在中后期 MTG 的合成中起着十分重要 的作用，MTG 酶的交联是造成培养基中游离氨基酸浓度的迅速缺乏的原因之一，而游离 氨基酸的缺乏又会影响 MTG 酶的合成。为从根本上提高发酵水平，应对 MTG 合成的机
理进行探讨,并对发酵条件进行进一步优化。 2.5125 20120 0.515 1020304050607080 01020304050607080 图7-2-2MIG摇瓶发酵过程曲线图7-2-3摇瓶发酵过程中氨基酸的变化情况 ◆细胞干重:■ Residual淀粉:▲MTG酶活:◆总氨基酸:■总游离氨基酸
12 理进行探讨，并对发酵条件进行进一步优化。 2.5 1.0 0.5 0 1.5 2.0 t/h 0 4 8 12 16 0 10 20 30 40 50 60 70 80 (DCW)/g L-1 MTGAct./u mL-1 (Residual starch)/g L-1 25 10 5 0 15 20 0 5 10 15 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 t/h mp /g L-1 0 0.5 1.0 1.5 2.0 mf /g L-1 图7-2-2 MTG摇瓶发酵过程曲线 图7-2-3 摇瓶发酵过程中氨基酸的变化情况 ◆ 细胞干重；■ Residual 淀粉；▲ MTG酶活；◆ 总氨基酸；■ 总游离氨基酸
第三节谷氨酰胺转胺酶分批发酵的pH值及温度控制策略 引言 通过第二节研究可以看出,谷氨酰胺转胺酶的分批发酵是典型的细胞生长和产物合成 部分偶联的形式,细胞生长和产物合成所需控制的最佳条件不同。为了得到较高的MIG的 合成速率和产率,控制较佳的环境条件非常重要。 底物分子的离子化状态因发酵液中的pH值的变化而改变。pH值的变化不仅影响基质 的离子化状态,也影响蛋白质分子的离子化状态,尤其是酶,对pH值变化较为敏感。微 生物生长及产物形成必需进行多种多样的酶催化反应,因此pH值是影响细胞及产物形成 的重要的环境因素。通过控制培养基的pH值,往往可以改变各种酶之间的产量比例。如 黑曲霉当培养基的pH值偏向中性时,可使α-淀粉酶产量增加而糖化酶减少,反之,当培 养基的pH值偏向酸性时,则糖化酶产量提高而α-淀粉酶的量降低 温度也是较重要的环境条件之一。因为微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化 下进行的,温度是保证酶活性的重要条件,从酶动力学来看,温度升高,反应速率加大 生长代谢加快,生产期提前。但因酶本身很易因受热而失去活性,温度越高,酶的失活也 越快,表现在菌体易于衰老,发酵周期的缩短,从而影响产物的最终产量。因此在发酵系 中必须保证稳定而合适的温度环境 细胞产酶的最适温度与最适生长温度有所不同,而且往往低于最适生长温度。例如酱 油曲霉生产蛋白酶,在28℃条件下发酵,其蛋白酶产量比在40℃的条件下高2~4倍。为 此,对于有些酶的发酵生产,在生长阶段应将温度控制在细胞生长的最适温度范围内,而 在产酶阶段则需控制在产酶的最适温度。 本节在2.5L小罐中研究了控制pH值为5.5-80,温度为25℃~35℃的情况下,MIG 分批发酵过程中的动力学特征;详细探讨了pH值及温度对细胞干重、细胞产率以及MIG 酶活、酶产率及酶的比合成速率的影响:在此基础上得出了S. mobargense分批发酵生产 MrG的分阶段pH值及温度控制策略,并在小型发酵罐上进行了实验验证 、控制不同pH值对发酵过程的影响 (一)未控制pH值的MlG发酵过程 如图7-3-1所示(初始p值6.5,在整个发酵过程中不控制pH值)。可以看出,发酵 10h左右,细胞生长进入对数生长期,此时酶开始合成,当培养至30h左右,细胞的生长 进入平衡期,此时细胞干重达最大值22.2gL,残糖为4.3g/L,而酶继续合成至42h左右 才停止。由此可见,酶的合成伴随着细胞的生长而开始,但在细胞生长进入平衡期后,酶 还延续合成较长的一段时间,此现象表明对MTG发酵,必须充分了解不同发酵阶段细胞 生长和MG合成的最适ph
13 第三节 谷氨酰胺转胺酶分批发酵的 pH 值及温度控制策略 一、引言 通过第二节研究可以看出，谷氨酰胺转胺酶的分批发酵是典型的细胞生长和产物合成 部分偶联的形式，细胞生长和产物合成所需控制的最佳条件不同。为了得到较高的MTG的 合成速率和产率，控制较佳的环境条件非常重要。 底物分子的离子化状态因发酵液中的 pH 值的变化而改变。pH 值的变化不仅影响基质 的离子化状态，也影响蛋白质分子的离子化状态，尤其是酶，对 pH 值变化较为敏感。微 生物生长及产物形成必需进行多种多样的酶催化反应，因此 pH 值是影响细胞及产物形成 的重要的环境因素。通过控制培养基的 pH 值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。如： 黑曲霉当培养基的 pH 值偏向中性时，可使-淀粉酶产量增加而糖化酶减少，反之，当培 养基的 pH 值偏向酸性时，则糖化酶产量提高而-淀粉酶的量降低。 温度也是较重要的环境条件之一。因为微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化 下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，从酶动力学来看，温度升高，反应速率加大， 生长代谢加快，生产期提前。但因酶本身很易因受热而失去活性，温度越高，酶的失活也 越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期的缩短，从而影响产物的最终产量。因此在发酵系 统中必须保证稳定而合适的温度环境。 细胞产酶的最适温度与最适生长温度有所不同，而且往往低于最适生长温度。例如酱 油曲霉生产蛋白酶，在 28℃条件下发酵，其蛋白酶产量比在 40℃的条件下高 24 倍。为 此，对于有些酶的发酵生产，在生长阶段应将温度控制在细胞生长的最适温度范围内，而 在产酶阶段则需控制在产酶的最适温度。 本节在 2.5 L 小罐中研究了控制 pH 值为 5.5~8.0，温度为 25℃～35℃的情况下，MTG 分批发酵过程中的动力学特征；详细探讨了 pH 值及温度对细胞干重、细胞产率以及 MTG 酶活、酶产率及酶的比合成速率的影响；在此基础上得出了 S. mobaraense 分批发酵生产 MTG 的分阶段 pH 值及温度控制策略，并在小型发酵罐上进行了实验验证。 二、控制不同 pH 值对发酵过程的影响 (一)未控制 pH 值的 MTG 发酵过程 如图 7-3-1 所示(初始 pH 值 6.5，在整个发酵过程中不控制 pH 值)。可以看出，发酵 10 h 左右，细胞生长进入对数生长期，此时酶开始合成，当培养至 30 h 左右，细胞的生长 进入平衡期，此时细胞干重达最大值 22.2 g/L，残糖为 4.3 g/L, 而酶继续合成至 42 h 左右 才停止。由此可见，酶的合成伴随着细胞的生长而开始，但在细胞生长进入平衡期后，酶 还延续合成较长的一段时间，此现象表明对 MTG 发酵，必须充分了解不同发酵阶段细胞 生长和 MTG 合成的最适 pH
35 30N pH uncontrolled 25 050505 110 0102030405060 t/h 图7-3-1未控制pH值的MIG发酵过程曲线 ◆淀粉:■MTG酶活:▲细胞干重 (二)控制pH值的发酵过程 当pH值为5.0~5.5时菌体不生长,pH值为7.5~8.0生长较差,表明 S mobaraense 在酸性环境中不能正常生长繁殖,在微碱性环境中虽然能够进行繁殖,但正常的生长及产 物合成受到影响。可能是在酸性及碱性环境中,合成蛋白质分子的氢键不能正常形成,导 致蛋白质分子不能正常合成。 3.0 pH6.0 2.5 15 0102030405060 3.0 3.0 g15 050 ◆·0.5 a10 0102030405060 0102030405060 图7-3-2pH控制在不同水平时MG发酵过程曲线 ◆淀粉:■MIG酶活:▲细胞干重 图7-3-2为控制不同pH值时MrG的发酵过程曲线。从控制pH值6.0的曲线可以看 出,发酵54h左右,细胞干重为18.5gL,MIG酶活达185umL,残糖为3g/L,细胞 生长和产酶同步进行。当菌体干重达到最高点时MIG酶活也达到最大值,细胞生长停止
14 pH uncontrolled 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 t/h (DCW)/ g L-1 (RSC)/g L-1 MTG Act. /u mL-1 图 7-3-1 未控制 pH 值的 MTG 发酵过程曲线 ◆ 淀粉；■ MTG 酶活；▲ 细胞干重 (二)控制 pH 值的发酵过程 当 pH 值为 5.0～5.5 时菌体不生长，pH 值为 7.5～8.0 生长较差，表明 S. mobaraense 在酸性环境中不能正常生长繁殖，在微碱性环境中虽然能够进行繁殖，但正常的生长及产 物合成受到影响。可能是在酸性及碱性环境中，合成蛋白质分子的氢键不能正常形成，导 致蛋白质分子不能正常合成。 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 t/h 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 MTG Act. /u mL-1 (DCW)/ g L-1 (RSC)/g L-1 pH6.0 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 pH6.5 MTG Act. /u mL-1 (DCW)/ g L-1 (RSC)/g L-1 t/h 0 5 10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 t/h 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 MTG Act. /u mL-1 (DCW)/ g L-1 (RSC)/g L-1 pH 7.0 图 7-3-2 pH 控制在不同水平时 MTG 发酵过程曲线 ◆ 淀粉；■ MTG 酶活；▲ 细胞干重 图 7-3-2 为控制不同 pH 值时 MTG 的发酵过程曲线。从控制 pH 值 6.0 的曲线可以看 出，发酵 54 h 左右，细胞干重为 18.5 g/L，MTG 酶活达 1.85 u/mL，残糖为 3 g/L，细胞 生长和产酶同步进行。当菌体干重达到最高点时 MTG 酶活也达到最大值，细胞生长停止
后,酶的合成也立即停止,可能是在此pH条件下,合成该酶所对应的mRNA不太稳定 从图中还可以看出,20h前细胞生长较缓慢,延滞期较长,20h后细胞生长较快,所以最 终达到最大细胞干重的时间较长。可以认为,pH为60时细胞可以生长和产酶,但该pH 并不是最适的pH 在p为65的发酵过程曲线中,发酵开始10h后,细胞干重迅速增加,伴随着细胞 的生长酶也开始不断合成,20h以后菌体干重的增加速率减慢,至42h达到最大值,而酶 则以较快的速率合成至48h左右才停止。表明此条件下的产酶期不同于pH为60的产酶 期。控制pH为70时的发酵过程曲线,曲线的变化形态和pH为6.5的发酵过程曲线基本 致,所不同的是,细胞生长延滞期较短。由此可见,控制不同的pH值,会对细胞生长 和酶合成产生显著的影响 三、pH对细胞比生长速率及MrG比合成速率的影响 (一)pH对细胞比生长速率的影响 不同pH值下的比生长速率(u)是由细胞生长数据得到的。用 Grooftool绘图软件对图 7-3-1及7-32中生长数据进行插值计算(时间间隔为0.1h),再用 Excel软件求解得到不同 时刻的μ,得到不同pH值下的μ~t关系曲线,如图7-3-3所示。可以看出,在发酵前12h 内,pH为70的发酵过程比生长速率高于其它条件下的值,12h后pH为65的发酵过程 比生长速率高于其它条件下的值。图7-3-4为不同pH值下最大比生长速率的变化曲线 可以看出,S. mobargense细胞在pH为5.5~7.5的范围内均能生长,但μ在此范围内受pH 变化的影响很大,pH为65时达到最大值Q.185h。由此可见,在MIG发酵前期,宜采 用pH值7.0进行发酵,这样不仅可以缩短发酵延滞期,减少总的发酵时间,还可以获得 高的细胞比生长速率 0.20 0.15 0.15 0.10 0.10 0.05 0102030405060 45678910 H 图7-3-3不同pH值下细胞比生长速率图7-3-4pH对细胞最大比生长速率的影响 pH:1-6.52-60,3-不控制;4-70 (二)pH对MG产率、生产强度及MTG比合成速率的影响 不同pH值控制方式下,MIG酶活、产率(YMG)及生产强度,如表7-3-1所示。从表 7-3-1中可以看出,当pH值控制在6.5时,MIG酶活、YM以及生产强度均最高,分别 达到20u/mL、1334ug和60.4u(Lh)
15 后，酶的合成也立即停止，可能是在此 pH 条件下，合成该酶所对应的 mRNA 不太稳定。 从图中还可以看出，20 h 前细胞生长较缓慢，延滞期较长，20 h 后细胞生长较快，所以最 终达到最大细胞干重的时间较长。可以认为，pH 为 6.0 时细胞可以生长和产酶，但该 pH 并不是最适的 pH。 在 pH 为 6.5 的发酵过程曲线中，发酵开始 10 h 后，细胞干重迅速增加，伴随着细胞 的生长酶也开始不断合成，20 h 以后菌体干重的增加速率减慢，至 42 h 达到最大值，而酶 则以较快的速率合成至 48 h 左右才停止。表明此条件下的产酶期不同于 pH 为 6.0 的产酶 期。控制 pH 为 7.0 时的发酵过程曲线，曲线的变化形态和 pH 为 6.5 的发酵过程曲线基本 一致，所不同的是，细胞生长延滞期较短。由此可见，控制不同的 pH 值，会对细胞生长 和酶合成产生显著的影响。 三、pH 对细胞比生长速率及 MTG 比合成速率的影响 (一)pH 对细胞比生长速率的影响 不同 pH 值下的比生长速率()是由细胞生长数据得到的。用 Grooftool 绘图软件对图 7-3-1 及 7-3-2 中生长数据进行插值计算(时间间隔为 0.1 h)，再用 Excel 软件求解得到不同 时刻的，得到不同 pH 值下的～t 关系曲线，如图 7-3-3 所示。可以看出，在发酵前 12 h 内，pH 为 7.0 的发酵过程比生长速率高于其它条件下的值，12 h 后 pH 为 6.5 的发酵过程 比生长速率高于其它条件下的值。图 7-3-4 为不同 pH 值下最大比生长速率的变化曲线。 可以看出，S. mobaraense 细胞在 pH 为 5.5～7.5 的范围内均能生长，但在此范围内受 pH 变化的影响很大，pH 为 6.5 时达到最大值 0.185 h -1。由此可见，在 MTG 发酵前期，宜采 用 pH 值 7.0 进行发酵，这样不仅可以缩短发酵延滞期，减少总的发酵时间，还可以获得 高的细胞比生长速率。 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0 10 20 30 40 50 60 t/h 1 2 3 4 cell/h-1 0 0.05 0.10 0.15 0.20 4 5 6 7 8 9 10 pH max/h-1 图 7-3-3 不同 pH 值下细胞比生长速率 图 7-3-4 pH 对细胞最大比生长速率的影响 pH: 1─6.5; 2─6.0; 3─不控制; 4─7.0 (二)pH 对 MTG 产率、生产强度及 MTG 比合成速率的影响 不同 pH 值控制方式下，MTG 酶活、产率(YMTG)及生产强度，如表 7-3-1 所示。从表 7-3-1 中可以看出，当 pH 值控制在 6.5 时，MTG 酶活、YMTG 以及生产强度均最高，分别 达到 2.90 u/mL、133.4 u/g 和 60.4 u/(Lh)