《发酵工程》课程教学资源（讲义）第七章 谷氨酰胺转氨胺酶发酵过程优化

并就温度对细胞生长及产酶影响开展模型化研究 (3)探讨MTG发酵过程的搅拌及溶氧浓度对细胞生长及产酶的影响,并考察MTG发 酵体系的流变学特性、搅拌功率的计算、混合和传氧系数等,为MIG工业化生产时反应 器的设计选型提供依据,最后提出MIG发酵生产的搅拌及溶氧浓度控制策略 (4考察MG发酵过程中影响菌丝球增殖形态的诸多因素,深入探讨菌丝球増殖形态 与产酶之间的关系,确定产酶的最适菌丝球大小,并提出控制最适菌丝球大小的策略。进 而提出菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的理论,把菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的 理论应用于实际生产过程中; (5)根据MIG的合成途径,通过质、能衡算和解析,计算主要物质的代谢流分布,确 定S. mobargense细胞培养过程的营养要求;通过对MrG的组成氨基酸水平的跟踪检测, 确定MIG发酵过程中的关键控制点,为补料优化控制提供重要依据 (6考察生产菌种对廉价底物的利用能力,并在小罐中研究淀粉的预处理对MrG发酵 结果的影响,然后根据体积传氧系数相等的准则,将MTG发酵由5L罐逐级放大到300L 罐,为实现发酵法生产MIG的工业化奠定基础

6 并就温度对细胞生长及产酶影响开展模型化研究； (3)探讨 MTG 发酵过程的搅拌及溶氧浓度对细胞生长及产酶的影响，并考察 MTG 发 酵体系的流变学特性、搅拌功率的计算、混合和传氧系数等，为 MTG 工业化生产时反应 器的设计选型提供依据，最后提出 MTG 发酵生产的搅拌及溶氧浓度控制策略； (4)考察 MTG 发酵过程中影响菌丝球增殖形态的诸多因素，深入探讨菌丝球增殖形态 与产酶之间的关系，确定产酶的最适菌丝球大小，并提出控制最适菌丝球大小的策略。进 而提出菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的理论，把菌丝球生长及菌丝球内氧浓度分布的 理论应用于实际生产过程中； (5)根据 MTG 的合成途径，通过质、能衡算和解析，计算主要物质的代谢流分布，确 定 S. mobaraense 细胞培养过程的营养要求；通过对 MTG 的组成氨基酸水平的跟踪检测， 确定 MTG 发酵过程中的关键控制点，为补料优化控制提供重要依据； (6)考察生产菌种对廉价底物的利用能力，并在小罐中研究淀粉的预处理对 MTG 发酵 结果的影响，然后根据体积传氧系数相等的准则，将 MTG 发酵由 5L 罐逐级放大到 300 L 罐，为实现发酵法生产 MTG 的工业化奠定基础

第二节谷氨酰胺转胺酶的摇瓶发酵条件研究 引言 20世纪80年代末,Ando和 Motoki等人首先报道了利用微生物发酵法生产谷氨酰胺 转胺酶的方法,其中Ando等人从5000株左右的菌株中发现S. mobargense等能够生产这 种酶。近年来,国外加快了微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的研究,并使之应用于食品 工业,而国内有关这方面的研究报道目前还比较少 影响细胞产酶的因素不是孤立的,而是互相联系,相互制约的。通常,菌种的生长与 产酶未必同步,产酶量也并不完全与微生物生长的程度成正比。为了使菌体最大限度地产 酶,除了根据菌种特性或生产条件选择恰当的培养基外,还应当为菌种在各个生理时期创 造不同的培养环境,如pH值,温度,溶氧等。因此,首先考察了部分环境及营养条件对 MIG摇瓶发酵的影响。 、种子生长过程曲线及种龄的确定 种子生长过程曲线如图72-1所示。可以看出,20h后细胞生长速率明显加快,在44h 后细胞干重开始下降,表明S. mobargense对数生长期为20~44h 16 图7-2-1茂原链轮丝菌的种子生长过程曲线 为了获得最佳的种龄,采用不同种龄的种子进行摇瓶发酵试验,结果如表7-2-1所示 可以看出,用40h种龄的种子进行发酵所获得菌体干重及酶活均达到最大。镜检发现,此 时的种子菌丝粗壮,且无自溶,表明细胞处于生长旺盛期。因此确定适宜的种龄为40h 表7-2-1种龄对MIG发酵的影响 种龄/h 36 40 MTG酶活/umL 1.501.841.64 细胞干重/g 12.612.912.6 剩余淀粉浓度/gL 三、环境条件对MTIG摇瓶发酵过程的影响 (一)初始pH值对菌体生长和MG合成的影响 如表7-22所示。在初始pH值为7.0时,细胞干重和MTG酶活均达到了最大值,分别为 12.3g/L和160umL

7 第二节 谷氨酰胺转胺酶的摇瓶发酵条件研究 一、引言 20 世纪 80 年代末，Ando 和 Motoki 等人首先报道了利用微生物发酵法生产谷氨酰胺 转胺酶的方法，其中 Ando 等人从 5000 株左右的菌株中发现 S. mobaraense 等能够生产这 种酶。近年来，国外加快了微生物发酵法生产谷氨酰胺转胺酶的研究，并使之应用于食品 工业，而国内有关这方面的研究报道目前还比较少。 影响细胞产酶的因素不是孤立的，而是互相联系，相互制约的。通常，菌种的生长与 产酶未必同步，产酶量也并不完全与微生物生长的程度成正比。为了使菌体最大限度地产 酶，除了根据菌种特性或生产条件选择恰当的培养基外，还应当为菌种在各个生理时期创 造不同的培养环境，如pH值，温度，溶氧等。因此，首先考察了部分环境及营养条件对 MTG摇瓶发酵的影响。 二、种子生长过程曲线及种龄的确定 种子生长过程曲线如图7-2-1所示。可以看出，20 h后细胞生长速率明显加快，在44 h 后细胞干重开始下降，表明S. mobaraense的对数生长期为2044 h。 t/h (DCW)/g L-1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 2 4 6 8 10 12 14 16 图7-2-1 茂原链轮丝菌的种子生长过程曲线 为了获得最佳的种龄，采用不同种龄的种子进行摇瓶发酵试验，结果如表7-2-1所示。 可以看出，用40 h种龄的种子进行发酵所获得菌体干重及酶活均达到最大。镜检发现，此 时的种子菌丝粗壮，且无自溶，表明细胞处于生长旺盛期。因此确定适宜的种龄为40 h。 表 7-2-1 种龄对 MTG 发酵的影响 种龄 / h 36 40 44 MTG酶活/ umL-1 1.50 1.84 1.64 细胞干重 / gL -1 12.6 12.9 12.6 剩余淀粉浓度 / gL -1 3.9 4.7 5.3 三、环境条件对 MTG 摇瓶发酵过程的影响 (一)初始 pH 值对菌体生长和 MTG 合成的影响 如表7-2-2所示。在初始pH值为7.0时，细胞干重和MTG酶活均达到了最大值，分别为 12.3 g/L和1.60 u/mL

表7-2-2pH对菌体生长和MIG酶活的影响 初始pH细胞干重剩余淀粉浓度MG酶活 /g 10.6 6.3 l13 147 12.0 19 6.7 l1.6 1.8 158 7.0 2.0 1.60 1.0 143 (二)温度对菌体生长及MIG酶活的影响 见表7-2-3。可以看出,当温度为30℃时,最适合于细胞生长和产酶,此时细胞干重及 MIG酶活均最高,达到13.2g/L及1.72u/mL 表7-2-3温度对菌体生长和MIG酶活的影响 温度细胞干重剩余淀粉浓度MIG酶活 /gL /gL 10.6 14 1.26 1.08 (三)接种量对菌体生长和MG合成的影响 接种量对细胞生长和MG合成的影响见表7-2-4。较适宜的接种量为5-20%(v/) 表7-2-4接种量对菌体生长和MIG酶活的影响 接种量细胞干重剩余淀粉浓度MIG酶活 /%(V/v)/gL1 /g L /u. mL-I 11.0 116 1.8 13.3 13 (四)装液量对MIG合成的影响 500mL三角瓶中不同装液量对MTG发酵的影响如表7-2-5所示。装液量从30mL提高到 100mL后,酶活增加了35%装液量为100mL时,酶活最高为187u/mL,也比装液量为140 mL时的酶活高出30%。由此可见,500mL三角瓶较适宜的装液量为100mL 表7-2-5装液量对MTG发酵的影响 体积/mL 100140 MTG酶活/umL11.371.541681.871.40 细胞干重/gL 2.812.012412.812 剩余淀粉浓度/gL4048464952 四、营养条件对MTrG发酵过程的影响

8 表 7-2-2 pH 对菌体生长和 MTG 酶活的影响 初始pH 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 6.0 10.6 2.4 1.36 6.3 11.3 1.5 1.47 6.5 12.0 1.9 1.55 6.7 11.6 1.8 1.58 7.0 12.3 2.0 1.60 7.3 11.0 1.7 1.43 (二)温度对菌体生长及 MTG 酶活的影响 见表7-2-3。可以看出，当温度为30℃时，最适合于细胞生长和产酶，此时细胞干重及 MTG酶活均最高，达到13.2 g/L及1.72 u/mL。 表 7-2-3 温度对菌体生长和 MTG 酶活的影响 温度 /℃ 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 25 8.2 3.5 0.82 28 10.6 2.8 1.14 30 13.2 1.4 1.72 32 12.4 2.0 1.26 35 11.6 2.7 1.08 (三)接种量对菌体生长和 MTG 合成的影响 接种量对细胞生长和MTG合成的影响见表7-2-4。较适宜的接种量为520%(v/v)。 表 7-2-4 接种量对菌体生长和 MTG 酶活的影响 接种量 / %(v/v) 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 2 10.2 2.5 0.82 5 11.0 2.1 1.45 10 11.6 1.8 1.54 15 12.5 1.7 1.59 20 13.3 1.3 1.68 (四)装液量对 MTG 合成的影响 500 mL三角瓶中不同装液量对MTG发酵的影响如表7-2-5所示。装液量从30 mL提高到 100 mL后，酶活增加了35%。装液量为100 mL时，酶活最高为1.87 u/mL，也比装液量为140 mL时的酶活高出30%。由此可见，500 mL三角瓶较适宜的装液量为100 mL。 表 7-2-5 装液量对 MTG 发酵的影响 体积 / mL 30 50 80 100 140 MTG酶活/ umL-1 1.37 1.54 1.68 1.87 1.40 细胞干重/gL -1 12.8 12.0 12.4 12.8 12.1 剩余淀粉浓度/gL -1 4.0 4.8 4.6 4.9 5.2 四、营养条件对 MTG 发酵过程的影响

(一)不同碳源种类对MIG发酵的影响 分别采用可溶性淀粉、葡萄糖、变性淀粉进行MrG的摇瓶发酵,结果如表7-2-6所示 可以看出,可溶性淀粉为合适的碳源 表7-2-6碳源种类对MTG发酵的影响 细胞干重剩余淀粉浓度MTG酶活 碳源 /g L 可溶性淀粉 12.9 4.7 葡萄糖 12.4 变性淙料乙酰基马铃薯淀粉 11.5 羟丙基淀粉 9.7 0.72 (二)初始淀粉浓度对MIG发酵的影响 以可溶性淀粉为碳源,比较了不同初始淀粉浓度对MIG发酵过程中菌体生长和产物 合成的影响(表7-2-7)。初始淀粉浓度20gL较为适宜。 表7-2-7初始淀粉浓度对菌体生长和MIG酶活的影响 初始淀粉浓度细胞干重剩余淀粉浓度 MTG酶活 /gL- /g-L- /umL- 12.3 1.9 43.0 0.75 (三)蛋白胨种类对MTG发酵的影响 蛋白胨是提供MTG发酵过程中菌体生长和产物合成所需氨基酸的重要有机氮源。由于 蛋白胨处理工艺的不同可能会影响其氨基酸组成,进而影响MTG发酵,因此,考察了不同 种类的蛋白胨对MIG发酵的影响(表7-2-8)。 表7-2-8蛋白胨种类对MTG发酵的影响 蛋白胨 蛋白胨 类型 (细菌F403)(生化试剂胰蛋白胨 细胞干重/gL 12.6 剩余淀粉浓度/gL 3.9 4.7 5.3 MIG酶活/mL1 00 78 04 从表7-2-8中可以看出,不同种类的蛋白胨对菌体生长影响不大,但对酶活影响显著 相对而言,生化试剂蛋白胨比较适于合成MTG (四)蛋白胨浓度对MIG发酵的影响 以生化试剂蛋白胨为氮源,考察了蛋白胨浓度对MTG发酵的影响,结果见表7-2-9。 可以看出其适宜用量为20gL

9 (一)不同碳源种类对 MTG 发酵的影响 分别采用可溶性淀粉、葡萄糖、变性淀粉进行MTG的摇瓶发酵，结果如表7-2-6所示。 可以看出，可溶性淀粉为合适的碳源。 表 7-2-6 碳源种类对 MTG 发酵的影响 碳源 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 可溶性淀粉 12.9 4.7 1.84 葡萄糖 12.4 9.0 1.63 变性淀粉 乙酰基马铃薯淀粉 11.5 0.86 5.1 羟丙基淀粉 9.7 0.72 10.4 (二)初始淀粉浓度对 MTG 发酵的影响 以可溶性淀粉为碳源，比较了不同初始淀粉浓度对MTG发酵过程中菌体生长和产物 合成的影响(表7-2-7)。初始淀粉浓度20 g/L较为适宜。 表 7-2-7 初始淀粉浓度对菌体生长和 MTG 酶活的影响 初始淀粉浓度 /gL -1 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 MTG酶活 /umL-1 10 6.2 0 0.8 20 12.3 1.9 1.65 30 11.9 12.3 1.58 40 11.3 21.4 1.23 50 10.7 31.7 0.98 60 10.2 43.0 0.75 (三)蛋白胨种类对 MTG 发酵的影响 蛋白胨是提供MTG发酵过程中菌体生长和产物合成所需氨基酸的重要有机氮源。由于 蛋白胨处理工艺的不同可能会影响其氨基酸组成，进而影响MTG发酵，因此，考察了不同 种类的蛋白胨对MTG发酵的影响(表7-2-8)。 表 7-2-8 蛋白胨种类对 MTG 发酵的影响 类型 蛋白胨 (细菌F403) 蛋白胨 (生化试剂) 胰蛋白胨 细胞干重/gL -1 12.6 12.9 12.6 剩余淀粉浓度/gL -1 3.9 4.7 5.3 MTG酶活/umL-1 1.00 1.78 1.04 从表7-2-8中可以看出，不同种类的蛋白胨对菌体生长影响不大，但对酶活影响显著。 相对而言，生化试剂蛋白胨比较适于合成MTG。 (四)蛋白胨浓度对 MTG 发酵的影响 以生化试剂蛋白胨为氮源，考察了蛋白胨浓度对MTG发酵的影响，结果见表7-2-9。 可以看出其适宜用量为20 g/L

表7-2-9蛋白胨用量对MTG发酵的影响 蛋白胨/gL1 20 MIG酶活mL 1.001851.04 细胞干重/gL 12.612.912.0 剩余淀粉浓度/gL3.94753 (五)酵母膏浓度对MIG发酵的影响 如表7-2-10所示。可见,酵母膏用量较低时菌体生长较差:用量较高时,菌体生长较 好,但酶活较低。所以较适宜的酵母膏用量为2g/L,此时MTG酶活最高185umL 表7-2-10酵母膏用量对MIG发酵的影响 酵母膏/gL123 MIG酶活/mL11.071.851.54 细胞干重/gL11.712.913.8 剩余淀粉浓度/gL1424.73.2 (六)产酶促进剂对MIG发酵的影响 产酶促进剂能增加细胞膜的通透性,从而使细胞内的酶容易透过细胞膜分泌出来,提 高酶产量。很多表面活性剂是产酶促进剂,从表72-1可以看出,不同种类的产酶促进剂 均对MTG的酶活水平均有不同程度的促进。其中,聚甘油醚最有利于产酶,MTG酶活最 高达2.12umL,比对照组提高了40%以上。 表7-2-11产酶促进剂对MTG发酵的影响 表面活性剂MIG酶活细胞干重剩余淀粉浓度 /umL- g 对照 4.8 聚山梨醇酯-80 1.75 12.8 3.2 聚甘油醚 2.12 聚乙烯醇124 13.4 6.2 (七)MrG发酵培养基组成的正交试验优化 选择对MIG发酵有较大影响的淀粉、蛋白胨及酵母膏这三个因素进行L34正交试验, 实验结果及方差分析如表72-12,7-2-13所示

10 表 7-2-9 蛋白胨用量对 MTG 发酵的影响 蛋白胨/gL -1 15 20 25 MTG酶活/umL-1 1.00 1.85 1.04 细胞干重/gL -1 12.6 12.9 12.0 剩余淀粉浓度/gL -1 3.9 4.7 5.3 (五)酵母膏浓度对 MTG 发酵的影响 如表7-2-10所示。可见，酵母膏用量较低时菌体生长较差；用量较高时，菌体生长较 好，但酶活较低。所以较适宜的酵母膏用量为2 g/L，此时MTG酶活最高1.85 u/mL。 表 7-2-10 酵母膏用量对 MTG 发酵的影响 酵母膏/gL -1 1 2 3 MTG 酶活/umL-1 1.07 1.85 1.54 细胞干重/gL -1 11.7 12.9 13.8 剩余淀粉浓度/gL -1 4.2 4.7 3.2 (六)产酶促进剂对 MTG 发酵的影响 产酶促进剂能增加细胞膜的通透性，从而使细胞内的酶容易透过细胞膜分泌出来，提 高酶产量。很多表面活性剂是产酶促进剂，从表7-2-11可以看出，不同种类的产酶促进剂 均对MTG的酶活水平均有不同程度的促进。其中，聚甘油醚最有利于产酶，MTG酶活最 高达2.12 u/mL，比对照组提高了40%以上。 表 7-2-11 产酶促进剂对 MTG 发酵的影响 表面活性剂 MTG 酶活 /umL-1 细胞干重 /gL -1 剩余淀粉浓度 /gL -1 对照 1.64 12.0 4.8 聚山梨醇酯-80 1.75 12.8 3.2 聚甘油醚 2.12 13.2 3.7 聚乙烯醇 124 2.02 13.4 6.2 (七)MTG 发酵培养基组成的正交试验优化 选择对 MTG 发酵有较大影响的淀粉、蛋白胨及酵母膏这三个因素进行 L3 4 正交试验， 实验结果及方差分析如表 7-2-12，7-2-13 所示