SgRNA的设计 ·选择PAM(NGG)5端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即 敲除的靶位点。(PAM,Protospacer adjacent motifs原间隔序列 临近基序。一般形式为NGG,其作用是将间隔序列定位于入侵 的噬菌体或质粒的DNA序列中) 原则： ·选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一， 否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。 ·优先选择DSB位点的侧翼存在重复序列（如果DSB的侧翼存在重 复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基 的缺失)。 ·PAM的5端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）
sgRNA 的设计 • 选择 PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即 敲除的靶位点。(PAM，Protospacer adjacent motifs 原间隔序列 临近基序。一般形式为 NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵 的噬菌体或质粒的 DNA 序列中) 原则： • 选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一， 否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。 • 优先选择 DSB 位点的侧翼存在重复序列（如果 DSB 的侧翼存在重 复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基 的缺失）。 • PAM 的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）
构建重组质粒 构建方案： 1.一是将gRNA与Cas9连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载 体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于 药物筛选) 2. 二是将gRNA与Cas9分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同 的荧光报告基因或抗性基因 载体选择： 慢病毒载体 以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基 因治疗载体。区别于腺病毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的 传代表达
构建重组质粒 构建方案 ： 1. 一是将gRNA 与 Cas9 连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载 体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于 药物筛选） 。 2. 二是将 gRNA与 Cas9 分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同 的荧光报告基因或抗性基因 载体选择： 慢病毒载体 以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基 因治疗载体。区别于腺病毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的 传代表达