*实验四突变位点的序列分析（注意：该实验由参加果蝇兴趣小组的同学完成）一、实验目的1、掌握测序的原理和实验过程2、解读序列峰图二、实验原理2.3'ddNTP与普通dNTP不同之处在于它们在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基。它们可以在DNA聚合酶作用下通过其5'三磷酸基团掺入到正在增长的DNA链中，但由于没有3羟基，它们不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在增长的DNA链不能继续延伸。这样，在DNA合成反应的4种普通dNTP种加入少量的一种ddNTP后，链延伸将于偶然发生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组肃立的酶反应种分别采用4种不同的ddNTP，结果将产生4组寡核苷酸，他们将分别终止于模板链的每一个A、每一个C、每一个G、每一个T的位置上。自动测序的优点之一是荧光发色基因吸收了激光束提供的农两而发射光信号，信号被监测器检测到并穿送至计算机，经整理显示出4种彩色图像。ans图5双脱氧法测序原理三、实验条件1、主要设备混合仪、离心机、PCR扩增仪、自动测序仪、水浴箱、高压电泳仪2、主要试剂（1）10XTBE缓冲液：Tris碱108g，硼酸55g，0.5mo1/LEDTA（pH8.0)40ml，加去离子水至1L。(2）40%聚丙稀酰胺：丙烯酰胺（测序级）190g、甲叉双丙烯酰胺10g，溶于500mlddH20
*实验四 突变位点的序列分析 （注意：该实验由参加果蝇兴趣小组的同学完成） 一、实验目的 1、掌握测序的原理和实验过程 2、解读序列峰图 二、实验原理 2',3'ddNTP 与普通 dNTP 不同之处在于它们在脱氧核糖的 3'位置缺少一个羟基。它们可 以在 DNA 聚合酶作用下通过其 5'三磷酸基团掺入到正在增长的 DNA 链中，但由于没有 3' 羟基，它们不能同后续的 dNTP 形成磷酸二酯键，因此，正在增长的 DNA 链不能继续延伸。 这样，在 DNA 合成反应的 4 种普通 dNTP 种加入少量的一种 ddNTP 后，链延伸将于偶然发 生但却十分特异的链终止展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决于从用以起 始 DNA 合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在 4 组肃立的酶反应种分别 采用 4 种不同的 ddNTP，结果将产生 4 组寡核苷酸，他们将分别终止于模板链的每一个 A、 每一个 C、每一个 G、每一个 T 的位置上。自动测序的优点之一是荧光发色基因吸收了激光 束提供的农两而发射光信号，信号被监测器检测到并穿送至计算机，经整理显示出 4 种彩色 图像。 图 5 双脱氧法测序原理 三、实验条件 1、主要设备 混合仪、离心机、PCR 扩增仪、自动测序仪、水浴箱、高压电泳仪 2、主要试剂 ⑴ 10×TBE 缓冲液:Tris 碱 108g，硼酸 55g，0.5mol/L EDTA(pH8.0)40ml，加去离子 水至 1L。 ⑵ 40％聚丙稀酰胺：丙烯酰胺（测序级）190g、甲叉双丙烯酰胺 10g，溶于 500ml ddH2O
中，混匀，加一汤勺MB一树脂，混匀（过滤，装入棕色瓶，4℃保存）。也可以买40%聚丙稀酰胺（19：1）产品，直接使用。(3）10%过硫酸铵：1g过硫酸铵溶于终量为10ml的去离子水溶液中，4℃保存，试用期<1周。（4）6%聚丙烯酰胺一尿素胶：96g尿素，120ml10XTBE，先加水1L，稍加热，持续搅拌，完全溶解后，用0.45孔径的过滤器去处杂质，再加入300ml40%聚丙烯酰胺，补加去离子水，至总体积2000ml，4℃保存。(5）测序试剂盒：Perkin一ElmerSequencingKit（6）无水乙醇四、实验方法和步骤1.测序胶的制备（以PE公司生产的ABIPRISM377DNA自动测序仪为例）(1)胶板的清洗和组装：清洗制胶玻璃板时可用松软的海绵沾少许洗涤剂擦洗，然后温水反复冲洗多次，再用蒸馏水冲洗干净。②用无水乙醇溶液擦洗玻璃板内面2～3次，再用镜头纸擦干。③分别将擦净的玻璃间隔片放在玻璃板和恒温板的边缘固定位置。④两边用强力夹对称扣紧，调好制胶玻璃板的水平后，即可灌胶。（2）聚内烯酰胺一尿素胶的配制：核苷酸序列的数量和质量都取决于聚内烯酰胺的质量，而丙烯酰胺浓度则取决于待分析DNA片断的长度。选用6%聚丙烯酰胺胶溶液可读出距离引物5端25～400bp之间，如果要读出距离引物5更远的序列，可选用4%5%的聚丙烯酰胺溶液来测定，反之，要选择高浓度的聚丙烯酰胺胶。另外，如果适当降低ddNTP/dNTP浓度比例，便可测到较长的可读序列DNA片断。(3）制胶①230ul过硫酸铵加到60ml6%聚丙烯酰胺一尿素胶溶液内，混匀后，再加75ulTEMED迅速转动烧杯，混匀溶液。②用50ml注射器吸入胶溶液，从胶板的一侧线性平行，连续缓慢灌注，避免出现气泡。③在胶板的上方，插入平端梳子。灌胶后可在2～24h之间使用。2.测序模板DNA聚合酶延伸反应这一过程能提高信号强度，减少操作复杂性及DNA聚合酶的用量。确保测序的可重复性和可靠性，使用试剂盒使测序反应极为方便，组成如下：ddH2018 μlCy5标记引物2 μlPCR产物2~3μl10×反应缓冲液4 μlddNTP2 μl DMSO2 μl具体操作步骤如下：(1）用记号笔标记好0.5ml彩色Eppendorf管的序号，例如：
中，混匀，加一汤勺 MB－树脂，混匀（过滤，装入棕色瓶，4℃保存）。也可以买 40％聚丙稀酰胺（19：1）产品，直接使用。 ⑶ 10%过硫酸铵：1g 过硫酸铵溶于终量为 10ml 的去离子水溶液中，4℃保存，试用期 <1 周。 ⑷ 6%聚丙烯酰胺－尿素胶：96g 尿素，120ml10×TBE，先加水 1L,稍加热，持续搅拌， 完全溶解后，用 0.45 孔径的过滤器去处杂质，再加入 300ml40%聚丙烯酰胺，补加 去离子水，至总体积 2000ml，4℃保存。 ⑸ 测序试剂盒：Perkin－Elmer Sequencing Kit ⑹ 无水乙醇 四、实验方法和步骤 ⒈测序胶的制备（以 PE 公司生产的 ABI PRISM 377DNA 自动测序仪为例） ⑴胶板的清洗和组装： ① 清洗制胶玻璃板时可用松软的海绵沾少许洗涤剂擦洗，然后温水反复冲洗多次，再用 蒸馏水冲洗干净。 ② 用无水乙醇溶液擦洗玻璃板内面 2～3 次，再用镜头纸擦干。 ③ 分别将擦净的玻璃间隔片放在玻璃板和恒温板的边缘固定位置。 ④ 两边用强力夹对称扣紧，调好制胶玻璃板的水平后，即可灌胶。 ⑵ 聚丙烯酰胺－尿素胶的配制： 核苷酸序列的数量和质量都取决于聚丙烯酰胺的质量， 而丙烯酰胺浓度则取决于待分析 DNA 片断的长度。选用 6％聚丙烯酰胺胶溶液可读出 距离引物 5'端 25～400bp 之间，如果要读出距离引物 5'更远的序列，可选用 4％～5％ 的聚丙烯酰胺溶液来测定，反之，要选择高浓度的聚丙烯酰胺胶。另外，如果适当降 低 ddNTP/dNTP 浓度比例，便可测到较长的可读序列 DNA 片断。 ⑶ 制胶 ① 230µl 过硫酸铵加到 60ml6％聚丙烯酰胺－尿素胶溶液内，混匀后，再加 75µlTEMED， 迅速转动烧杯，混匀溶液。 ② 用 50ml 注射器吸入胶溶液，从胶板的一侧线性平行，连续缓慢灌注，避免出现气泡。 ③ 在胶板的上方，插入平端梳子。灌胶后可在 2～24h 之间使用。 ⒉ 测序模板 DNA 聚合酶延伸反应 这一过程能提高信号强度，减少操作复杂性及 DNA 聚 合酶的用量。确保测序的可重复性和可靠性，使用试剂盒使测序反应极为方便，组成如 下： ddH2O 18 µl Cy5 标记引物 2 µl PCR 产物 2～3 µl 10×反应缓冲液 4 µl ddNTP 2 µl DMSO 2 µl 具体操作步骤如下： ⑴ 用记号笔标记好 0.5ml 彩色 Eppendorf 管的序号，例如：
10个绿色管1A~10A10个蓝色管1C~10C10个黄色管1G～10G10个红色管1IT~10T(2）在一个1.5ml灭菌的Eppendorf管，配制N个样品的混和液：ddH2018μl18N+ 18μlPrimer2μl2N+ 2μl4ul10X缓冲液4N+ 4μl2NDMSO2μl混匀，离心，置于冰中。(3）将2～3DNA模板，加在一个0.5ml的Eppendorf管，如有10个测序模板，就要在每个管上标记好序号（1，2，3·10）。(4）从步骤(2)的管中，吸出26叫l混和液，加到步骤(3)的1号管中，其余的管依次类推，用微量加样器轻轻上下混匀，避免出现气泡，短暂离心。(5）加2μulddNTP到步骤(1)的各管中：2μlddATP到1A~10A2ulddCTP到1C~10C2μlddGTP到1G~10G2ulddTTP到1T~10T(6）从步骤(4)的1号管中一次吸出6ul叫道步骤(1)中与1号管对应的1A,1C,1G,1T管中，2号，3号10号管依次类推。（7）在各反应管中加一滴液体石蜡，短暂离心。(8）将样品放入PCR仪中，启动热循环反应。反应参数（入ZAP载体）：94℃2min；94℃30s；5015s，72℃1min，20个循环：94℃30s，72℃1min，15个循环。(9）当热循环反应温度降到4℃时，在各管中加入4ulStopSolution终止反应，振荡或用手指弹匀使其终止作用完全，短暂离心，可立即上样或置于一20℃。3.样品上样和电泳1）上样前，将样品90℃加热变性5min，迅速插入冰中。(2）开机并将胶板固定在仪器上，在上下电泳槽倒入2000ml0.6×TBE电泳缓冲液。(3）输入各项电泳参数，当激光值>500，并已稳定时，即可开始上样。（4）轻轻拔出梳子，用注射器吸取槽内的电泳缓冲液并用7号注射针头冲洗胶口，至少三次。5）每孔上样6～8ul。一份样品分别加入A、C、G、T四个泳道，每板胶可测序10份样品(6）接通电源，在恒定功率下电泳。4.核苷酸序列的阅读自动测序仪连续采集的数据在计算机中储存并迅速加以处理，结果清晰准确，分辨率很高。操作者可以根于显示屏上的彩色此案是图像准确得分辨出某已DNA样品得碱基排列顺序。读序时根据计算机软件中碱基的代表符号，进行阅读和编辑。读序时一般读两次，并将两次结果输入到计算机，进行结果比较，并增亮显示有差异的区域；
10 个绿色管 1A～10A 10 个蓝色管 1C～10C 10 个黄色管 1G～10G 10 个红色管 1T～10T ⑵ 在一个 1.5ml 灭菌的 Eppendorf 管，配制 N 个样品的混和液： ddH2O 18µl 18N+ 18µl Primer 2µl 2N+ 2µl 10×缓冲液 4µl 4N+ 4µl DMSO 2µl 2N 混匀，离心，置于冰中。 ⑶ 将 2～3DNA 模板，加在一个 0.5ml 的 Eppendorf 管，如有 10 个测序模板，就要在每个 管上标记好序号（1，2，3.10）。 ⑷ 从步骤⑵的管中，吸出 26µl 混和液，加到步骤⑶的 1 号管中，其余的管依次类推，用 微量加样器轻轻上下混匀，避免出现气泡，短暂离心。 ⑸ 加 2µlddNTP 到步骤⑴的各管中： 2µl ddATP 到 1A～10A 2µl ddCTP 到 1C～10C 2µl ddGTP 到 1G～10G 2µl ddTTP 到 1T～10T ⑹ 从步骤⑷的 1 号管中一次吸出 6µl 叫道步骤⑴中与 1 号管对应的 1A,1C,1G,1T 管中，2 号，3 号.10 号管依次类推。 ⑺ 在各反应管中加一滴液体石蜡，短暂离心。 ⑻ 将样品放入 PCR 仪中，启动热循环反应。反应参数（λZAP 载体）：94℃2min；94℃ 30s；5015s，72℃1min，20 个循环；94℃30s，72℃1min，15 个循环。 ⑼ 当热循环反应温度降到 4℃时，在各管中加入 4µl Stop Solution 终止反应，振荡或用手 指弹匀使其终止作用完全，短暂离心，可立即上样或置于－20℃。 ⒊ 样品上样和电泳 ⑴ 上样前，将样品 90℃加热变性 5min，迅速插入冰中。 ⑵ 开机并将胶板固定在仪器上，在上下电泳槽倒入 2000ml 0.6×TBE 电泳缓冲液。 ⑶ 输入各项电泳参数，当激光值>500，并已稳定时，即可开始上样。 ⑷ 轻轻拔出梳子，用注射器吸取槽内的电泳缓冲液并用 7 号注射针头冲洗胶口，至少三次。 ⑸ 每孔上样 6～8µl。一份样品分别加入 A、C、G、T 四个泳道，每板胶可测序 10 份样品。 ⑹ 接通电源，在恒定功率下电泳。 ⒋核苷酸序列的阅读 自动测序仪连续采集的数据在计算机中储存并迅速加以处理，结果清晰准确，分辨率很 高。操作者可以根于显示屏上的彩色此案是图像准确得分辨出某已 DNA 样品得碱基排列顺 序。读序时根据计算机软件中碱基的代表符号，进行阅读和编辑。 读序时一般读两次，并将两次结果输入到计算机，进行结果比较，并增亮显示有差异的区域；
读序时要将DNA片断中碱基的错误率控制在2%以内。160170180TACG1WMWA图6测序峰图结果五、实验注意事项（1）在配制胶溶液和制胶的过程中，要戴手套，因为丙烯酰胺有强烈神经毒素，经皮肤吸收，在称取粉末时，注意呼吸道吸入。(2）用蒸馏水冲洗胶板或用镜头纸擦干胶板时，动作要轻，以防破坏玻璃板内的硅化层。(3）如果用乙醇擦洗时，一定要等乙醇挥发尽，才可制胶。（4）灌胶用的注射器，每次用后，用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，以防堵住。六、思考题如果是PCR产物直接测序，纯合位点和杂合位点的峰形将有何区别？七、实验报告根据自已所在的小组的实验操作，做一份实验报告；试对测序结果进行分析（附上测序峰图），并用测得序列与Genbank上的序列进行比对
读序时要将 DNA 片断中碱基的错误率控制在 2％以内。 图 6 测序峰图结果 五、实验注意事项 ⑴ 在配制胶溶液和制胶的过程中，要戴手套，因为丙烯酰胺有强烈神经毒素，经皮肤吸收， 在称取粉末时，注意呼吸道吸入。 ⑵ 用蒸馏水冲洗胶板或用镜头纸擦干胶板时，动作要轻，以防破坏玻璃板内的硅化层。 ⑶ 如果用乙醇擦洗时，一定要等乙醇挥发尽，才可制胶。 ⑷ 灌胶用的注射器，每次用后，用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，以防堵住。 六、思考题 如果是 PCR 产物直接测序，纯合位点和杂合位点的峰形将有何区别？ 七、实验报告 根据自己所在的小组的实验操作，做一份实验报告，试对测序结果进行分析（附上测序 峰图），并用测得序列与 Genbank 上的序列进行比对