实验二目标基因扩增一、实验目的1、掌握PCR的原理和方法。2、比较体内DNA复制与体外DNA片断扩增原理的异同。二、实验原理聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，简称PCR）是一种模拟天然DNA复制的体外扩增法。通过试管反应使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段，在短短几小时内扩增上百万倍。这一反应要求以下几个条件：①要有单链模板DNA与寡核苷酸引物形成的模板、引物复合物：②dNTPs作为酶反应底物（合成DNA新链的原料）：③适当pH值的缓冲液，尤其是其中Mg*浓度十分重要：④DNA聚合酶。扩增DNA片段的长度及特异性是由2个寡核苷酸引物的序列决定的，即引物与待扩增DNA片段两条链的两端序列分别互补。PCR就是反复进行变性一退火一引物延伸三个步骤的循环过程。1.变性：模板基因组DNA在高温（94～95℃）下变性，双螺旋结构解链成为单链。2.退火：将反应混合物降温，使引物与单链DNA模板（或从mRNA逆转录而来的cDNA）上互补的序列复性，即退火，形成模板-引物复合物。复性温度决定于引物的Tm值（7m～2（A+T）+4（G+C）），退火温度通常比理论计算的引物和模板的溶解温度低3-5℃。3.延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热的DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按5'-3”方向复制出互补DNA。经过上述变性一退火一引物延伸这样一个循环，模板DNA拷贝数增加1倍。在以后进行的循环过程中，新合成的DNA链都起看模板作用，因此，每经过一个循环，DNA拷贝数便增加1倍（×2）。n次循环后，拷贝数增加2"倍。进行2530个循环，拷贝数即可扩增上百万倍（10°）。扩增的DNA片段长度基本上都限定在两引物5端以内，在凝胶电泳上显示为一条特定长度的DNA区带。应该指出，扩增产物的指数式增加不是无限制进行的。可以想象得到，在PCR反应后期，模板拷贝数大量增加，引物及dNTPs的量被消耗得很多，其剩余量可能逐渐不足在很短时间（30～60s）内与所有模板都形成模板-引物复合物；或者酶活力不足以在规定的延伸时间内彻底完成如此大量的模板一引物复合物的延伸反应；以及退火时，模板互补链之间的复性逐渐增加等等，因此，扩增产物的增加逐渐由指数形式变为线性形式。但即使如此，进行30个循环，实际扩增倍数通常可达10°倍
实验二 目标基因扩增 一、实验目的 1、掌握 PCR 的原理和方法。 2、比较体内 DNA 复制与体外 DNA 片断扩增原理的异同。 二、实验原理 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，简称 PCR）是一种模拟天然 DNA 复制的 体外扩增法。通过试管反应使极少量的基因组 DNA 或 RNA 样品中的特定基因片段，在短 短几小时内扩增上百万倍。这一反应要求以下几个条件：①要有单链模板 DNA 与寡核苷酸引 物形成的模板、引物复合物；②dNTPs 作为酶反应底物（合成 DNA 新链的原料）；③适当 pH 值的缓冲液，尤其是其中 Mg2+浓度十分重要；④DNA 聚合酶。 扩增 DNA 片段的长度及特异性是由 2 个寡核苷酸引物的序列决定的，即引物与待扩增 DNA 片段两条链的两端序列分别互补。PCR 就是反复进行变性—退火—引物延伸三个步骤的 循环过程。 1. 变性:模板基因组 DNA 在高温(94～95℃)下变性，双螺旋结构解链成为单链。 2. 退火:将反应混合物降温，使引物与单链 DNA 模板（或从 mRNA 逆转录而来的 cDNA） 上互补的序列复性，即退火，形成模板-引物复合物。复性温度决定于引物的 Tm 值（Tm≈2 （A+T）+4(G+C)）,退火温度通常比理论计算的引物和模板的溶解温度低 3-5℃。 3. 延伸:溶液反应温度升至 72℃,耐热的 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板,在引物的引导 下,利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按 5’-3’方向复制出互补 DNA。 经过上述变性—退火—引物延伸这样一个循环，模板 DNA 拷贝数增加 1 倍。在以后进 行的循环过程中，新合成的 DNA 链都起着模板作用，因此，每经过一个循环，DNA 拷贝 数便增加 1 倍（×2）。n 次循环后，拷贝数增加 2 n 倍。进行 25～30 个循环，拷贝数即可扩 增上百万倍（106）。扩增的 DNA 片段长度基本上都限定在两引物 5′端以内，在凝胶电泳上 显示为一条特定长度的 DNA 区带。 应该指出，扩增产物的指数式增加不是无限制进行的。可以想象得到，在 PCR 反应后期， 模板拷贝数大量增加，引物及 dNTPs 的量被消耗得很多，其剩余量可能逐渐不足在很短时间 （30～60s）内与所有模板都形成模板-引物复合物；或者酶活力不足以在规定的延伸时间内 彻底完成如此大量的模板-引物复合物的延伸反应；以及退火时，模板互补链之间的复性逐 渐增加等等，因此，扩增产物的增加逐渐由指数形式变为线性形式。但即使如此，进行 30 个循环，实际扩增倍数通常可达 106 倍
cetotesliVE图2.PCR原理示意图三、实验条件（一）主要设备1.Eppendorf管、旋涡混匀器、台式离心机、加样器2.PCR扩增仪、微型凝胶电泳槽、电泳仪、紫外线检测仪（二）主要试剂1.引物I和II（浓度为10μmo1/L)2.dNTPs（即dATPs、dGTPs、dCTPs、dTTPs，浓度为10mmol/L）3.10XTagDNA聚合酶缓冲液4.TaqDNA聚合酶5.模板DNA6.50×TAE7. 琼脂糖四、实验方法和步骤（一）鸡性连锁矮小基因（dw）的扩增引物I：5—TTGTTCACTCACCACCAGGC—3引物II：5”—GATTCTCCTGGCAGAATCTC—3PCR反应体系在0.2mlEppendorf管中，依次加入：1.10×缓冲液2.5μl2μ110mmol/L4种dNTP混合液（pH8.0)2μl10mol/L正向引物2μl10μmol/L反向引物1~2单位TaqDNA聚合酶模板DNA50~100ng加ddHO至25叫
图 2. PCR 原理示意图 三、实验条件 （一）主要设备 1. Eppendorf 管、旋涡混匀器、台式离心机、加样器 2. PCR 扩增仪、微型凝胶电泳槽、电泳仪、紫外线检测仪 （二）主要试剂 1. 引物 I 和 II (浓度为 10µmol/L) 2. dNTPs（即 dATPs、dGTPs、dCTPs、dTTPs，浓度为 10mmol/L） 3. 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液 4. TaqDNA 聚合酶 5. 模板 DNA 6. 50×TAE 7. 琼脂糖 四、实验方法和步骤 (一) 鸡性连锁矮小基因（dw）的扩增 引物 I : 5’—TTGTTCACTCACCACCAGGC—3’ 引物 II: 5’—GATTCTCCTGGCAGAATCTC—3’ 1. PCR 反应体系 在 0.2ml Eppendorf 管中，依次加入： 10×缓冲液 2.5µl 10mmol/L4 种 dNTP 混合液(pH8.0) 2µl 10µmol/L 正向引物 2µl 10µmol/L 反向引物 2µl TaqDNA 聚合酶 1～2 单位 模板 DNA 50～100ng 加 ddH2O 至 25µl
1.向每一管中加入35叫矿物油。每加一管换一次吸头。2.振荡每只管，然后短暂离心。3．将管放到预热的热循环仪中，按下列程序开始循环：94℃一次(1) 预变性5min(2) 变性94℃Imin58℃(3)退火1min72℃(4)延伸3min(5)重复步骤(2)~(4)循环30次72℃一次(6)终延伸10min(7)保存4℃4.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。5.紫外分析仪检查电泳结果。(二）猪氟烷敏感基因（RYR1）的扩增引物I：5'一TGACCCCTAGGTGCTGGAT—3'引物II:5—GGAGGGTTCTAAGCTCTGGG—3'PCR反应体系在0.2mlEppendorf管中，依次加入：1.2.5川10X缓冲液2μl10mmol/L4种dNTP混合液（pH8.0)10μmol/L正向引物2.5μl2.5μ110μmol/L反向引物1~2单位TaqDNA聚合酶模板DNA50~100ng加水至25μ2.向每一管中加入35川矿物油。每加一管换一次吸头。3.振荡每只管，然后短暂离心。4.将管放到预热的热循环仪中，按下列程序开始循环：一次(I) 预变性94℃5min(2)变性94℃30s(3)退火60℃30s(4)延伸72℃30s(5)重复步骤(2)~(4)循环30次72℃一次(6)终延伸5min4℃(7)保存5.将PCR产物进行HhaI酶切，37℃反应2.5小时。酶切反应体系：10mlPCR产物10×酶切缓冲液1.5μl1~2单位HhaI内切酶
1. 向每一管中加入 35µl 矿物油。每加一管换一次吸头。 2. 振荡每只管，然后短暂离心。 3. 将管放到预热的热循环仪中，按下列程序开始循环： (1) 预变性 94℃ 5min 一次 (2) 变性 94℃ 1min (3) 退火 58℃ 1min (4) 延伸 72℃ 3min (5) 重复步骤(2)～(4)循环 30 次 (6) 终延伸 72℃ 10min 一次 (7) 保存 4℃ 4. 将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。 5. 紫外分析仪检查电泳结果。 (二) 猪氟烷敏感基因（RYR1）的扩增 引物 I : 5’—TGACCCCTAGGTGCTGGAT— 3’ 引物 II: 5’—GGAGGGTTCTAAGCTCTGGG—3’ 1. PCR 反应体系 在 0.2ml Eppendorf 管中，依次加入： 10×缓冲液 2.5µl 10mmol/L4 种 dNTP 混合液(pH8.0) 2µl 10µmol/L 正向引物 2.5µl 10µmol/L 反向引物 2.5µl TaqDNA 聚合酶 1～2 单位 模板 DNA 50～100ng 加水至 25µl 2. 向每一管中加入 35µl 矿物油。每加一管换一次吸头。 3. 振荡每只管，然后短暂离心。 4. 将管放到预热的热循环仪中，按下列程序开始循环： (1) 预变性 94℃ 5min 一次 (2) 变性 94℃ 30s (3) 退火 60℃ 30s (4) 延伸 72℃ 30s (5) 重复步骤(2)～(4)循环 30 次 (6) 终延伸 72℃ 5min 一次 (7) 保存 4℃ 5. 将 PCR 产物进行 HhaⅠ酶切，37℃反应 2.5 小时。 酶切反应体系： PCR 产物 10µl 10×酶切缓冲液 1.5µl HhaⅠ内切酶 1～2 单位
加水至156.电泳，紫外分析仪检查电泳结果。五、注意事项1.设计合成引物应注意：(1）最重要的是引物序列的特异性要高。可借助计算机与已知无关基因序列比对，同源性越低越好。(2）引物长度通常在15～25个碱基，使扩增片段在150～600bp最好。(3)G、C占碱基总数的50%~60%为宜。(4）用于同一个PCR反应的不同引物的3°部分应避免有互补序列。（5）在引物5端设计某限制性内切酶识别序列时，应适当多出几个碱基，以利于以后PCR产物的酶解。2.PCR注意事项(1）应采用高纯度的试剂及水，不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白。如遇不能得到特异扩增产物的DNA，可在沸水浴中煮5min，并立即通过一支SephadexG50离心柱纯化。经这样处理的DNA一般能得到满意的PCR效果，基因组DNA模板量一般在0.1～1Hg，过多反而扩增效果不佳。（2）反应试剂应分装成小量保存以减少使用次数，防止污染和避免有些试剂反复冻融而影响PCR效果。(3)dNTPs溶液呈强酸性，应调至Tag酶最适pH8.3后使用。（4）退火温度主要决定于引物的长度及序列，通常较Tm值稍低，引物Tm～4×（G+C)+2X（A+T)。如有非特异扩增产物，可适当升高退火温度。(5）设计合成的引物序列中有错配碱基或小缺失、小插入或限制酶识别序列时，在前3至5个循环时，宜使用更低的退火温度，然后逐渐升高退火温度。这是在此类情况下取得最佳PCR效果的关键。（6）延伸时间主要取决于所扩增DNA片段的长度。当片段长度≤400bp时，延伸30s即可。400～1000bp，延伸60s。更长时，可相应延长时间。第一次热变性后，应在10000r/min离心20s，使管内水汽充分凝聚并沉到管底。加(7)50叫矿物油也是防止水分蒸发，保持整个反应体系体积不变TaDNA聚合酶加量过多不但浪费，还可使非特异产物增加。(8)(9）所用Eppendorf管及加样头都应绝对清洁，尤其不应污染有过去的PCR产物。(10）微型凝胶检测PCR效果的方法虽简便快捷，但结果并非总是可靠。应认真细心操作。必要时可再次检查。六、思考题1、若扩增后出现非特异扩增带，试分析可能的原因2、若扩增后没有目的扩增带，试分析可能的原因。3、了解缓冲液的成分，试分析各成分的作用，七、实验报告
加水至 15µl 6. 电泳，紫外分析仪检查电泳结果。 五、注意事项 1. 设计合成引物应注意: (1) 最重要的是引物序列的特异性要高。可借助计算机与已知无关基因序列比对，同源 性越低越好。 (2) 引物长度通常在 15 ～25 个碱基，使扩增片段在 150～600bp 最好。 (3) G、C 占碱基总数的 50%～60%为宜。 (4) 用于同一个 PCR 反应的不同引物的 3′部分应避免有互补序列。 (5) 在引物 5′端设计某限制性内切酶识别序列时，应适当多出几个碱基，以利于以后 PCR 产物的酶解。 2. PCR 注意事项 (1) 应采用高纯度的试剂及水，不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA 聚合酶抑制剂 以及能结合 DNA 的蛋白。如遇不能得到特异扩增产物的 DNA，可在沸水浴中煮 5min，并立即通过一支 Sephadex G50 离心柱纯化。经这样处理的 DNA 一般能得到 满意的 PCR 效果，基因组 DNA 模板量一般在 0.1～1µg，过多反而扩增效果不佳。 (2) 反应试剂应分装成小量保存以减少使用次数，防止污染和避免有些试剂反复冻融而 影响 PCR 效果。 (3) dNTPs 溶液呈强酸性，应调至 Taq 酶最适 pH8.3 后使用。 (4) 退火温度主要决定于引物的长度及序列，通常较 Tm 值稍低，引物 Tm≈4×(G+C)+2 ×(A+T)。如有非特异扩增产物，可适当升高退火温度。 (5) 设计合成的引物序列中有错配碱基或小缺失、小插入或限制酶识别序列时，在前 3 至 5 个循环时，宜使用更低的退火温度，然后逐渐升高退火温度。这是在此类情况 下取得最佳 PCR 效果的关键。 (6) 延伸时间主要取决于所扩增 DNA 片段的长度。当片段长度≤400bp 时,延伸 30s 即可。400～1000bp，延伸 60s。更长时，可相应延长时间。 (7) 第一次热变性后，应在 10000r/min 离心 20s，使管内水汽充分凝聚并沉到管底。加 50µl 矿物油也是防止水分蒸发，保持整个反应体系体积不变。 (8) TaqDNA 聚合酶加量过多不但浪费，还可使非特异产物增加。 (9) 所用 Eppendorf 管及加样头都应绝对清洁，尤其不应污染有过去的 PCR 产物。 (10) 微型凝胶检测 PCR 效果的方法虽简便快捷，但结果并非总是可靠。应认真细心操 作。必要时可再次检查。 六、思考题 1、若扩增后出现非特异扩增带，试分析可能的原因。 2、若扩增后没有目的扩增带，试分析可能的原因。 3、了解缓冲液的成分，试分析各成分的作用。 七、实验报告
根据自己所在小组的实验操作，做一份实验报告，要求写明实验目的，实验步骤，实验结果（依据胶图分析说明是否为特异性扩增，扩增产物的分子量大小，目的片段的浓度、总量，PCR扩增质量等情况），注意标明自己样品的标号，并根据思考题分析实验的注意事项。参考文献：肖璐，李宁，戴茹娟，陈永福，吴常信，性连锁矮小鸡（dwdw）生长激素受体（cGHR）基因突变的精确定位，1996，农业生物技术学报，4（2）：174一178姜勋平，张牧，刘桂琼，丁家桐，刘红林，方美英，猪RYR1基因对繁殖性能的影响，1999，20（1):4851王修海，刘雯，张咸宁，王振华，《医学遗传学实验指导》（第一版），2001，科学出版社
根据自己所在小组的实验操作，做一份实验报告，要求写明实验目的，实验步骤，实验 结果（依据胶图分析说明是否为特异性扩增，扩增产物的分子量大小，目的片段的浓度、总 量，PCR 扩增质量等情况），注意标明自己样品的标号，并根据思考题分析实验的注意事项。 参考文献： 肖璐，李宁，戴茹娟，陈永福，吴常信，性连锁矮小鸡（dwdw）生长激素受体（cGHR）基 因突变的精确定位，1996，农业生物技术学报，4（2）：174－178 姜勋平，张牧，刘桂琼，丁家桐，刘红林，方美英，猪 RYR1 基因对繁殖性能的影响，1999， 20（1）：48－51 王修海，刘雯，张咸宁，王振华，《医学遗传学实验指导》（第一版），2001，科学出版社