国家自然科学基金申请书 202年本项研究继续获得国家自然科学基金资助(项目批准号30171194),重点 研究了出血性血小板病膜糖蛋白受体变化及中药对其的影响。归纳研究的重点内容: ELSA检测膜糖蛋白( Membrane Glycoprateins,GP)Ⅱb、Ⅲa含量减低,洗涤血小板 后又可恢复正常范围;流式细胞术测GPIb/ⅨX、GPIb/Ia、GPIb、GPIa及p-选择 素表达荧光强度均低于正常人(P<0.05);经中药治疗后,患者的血小板膜糖蛋白表达 增加,与正常组比较差异无显著性(P>005)而明显优于西药组(P<005)。提示益气 活血方在受体蛋白水平上调节血小板膜糖蛋白的表达是其治疗出血性血小板病的疗效 机理之一。值得指出的是,由于GPIb为血小板高亲和力凝血酶受体,而我们的研究 发现出血性血小板病患者GPIb低下,这就进一步启迪我们,该病发病机理可能与凝 血酶受体异常有关。 凝血酶是一个多功能血浆丝氨酸蛋白酶,它能活化血小板使之发生聚集。GPIb/Ⅸ Ⅴ复合物是血小板表面的重要膜糖蛋白,能与凝血酶结合,在血小板粘附及聚集过程 中起重要作用,长期以来被普遍认为是凝血酶受体。GPIb/Ⅸ/V包括4种成分:GP Iba、GPIbβ、GPⅨ、GPV。很多资料表明,凝血酶高亲和力结合位点于GPIb a,GPⅤ对凝血酶高亲和力结合位点形成有重要作用。近年来研究发现血小板表面还 存在一类重要的凝血酶受体,即PARs( protease-activated receptors),凝血酶的细胞反应 可部分地通过这一个G蛋白偶连受体的小家族介导进行信号传递,这一家族包括PARl PAR2、PAR3与PAR4四大成员。通常凝血酶反应由一个以上PARs受体介导,切割其 特定位点暴露新的氨基末端,从而形成一个固定配基与受体进行分子内结合,影响跨膜 信号传导。人类血小板表达PAR与PAR4受体,它们都能与G12/13、Gq家族偶连,并 通过分泌ADP引起P2Y12受体活化而间接激活Gi信号途径,引起血小板聚集、释放 以及膜糖蛋白的一系列改变。PARI具有高亲和力,低浓度凝血酶即诱导其活化,产生 快速、强劲的血小板反应。PAR4则亲和力较低,作用弱于PARl,由高浓度凝血酶活化, 可以成为PAR途径的补充。 PARs受体的研究在国内尚刚起步,而国际上正成为热点 因此进行凝血酶与血小板相互作用的研究,对于深刻了解出血性疾病的发病机制的机理 非常重要 本项目根据我们十余年来对出血性血小板病研究的初步结果及中医药治疗的疗效, 第6页 版本1003.094
国家自然科学基金申请书 第 6 页 版本 1.003.094 2002 年本项研究继续获得国家自然科学基金资助（项目批准号 30171194），重点 研究了出血性血小板病膜糖蛋白受体变化及中药对其的影响。归纳研究的重点内容： ELISA 检测膜糖蛋白（ Membrane Glycoprateins，GP）Ⅱb、Ⅲa 含量减低，洗涤血小板 后又可恢复正常范围；流式细胞术测 GPⅠb/Ⅸ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb、GPⅢa 及 p-选择 素表达荧光强度均低于正常人（P<0.05）；经中药治疗后，患者的血小板膜糖蛋白表达 增加，与正常组比较差异无显著性（P>0.05）而明显优于西药组（P<0.05）。提示益气 活血方在受体蛋白水平上调节血小板膜糖蛋白的表达是其治疗出血性血小板病的疗效 机理之一。值得指出的是，由于 GPⅠb 为血小板高亲和力凝血酶受体，而我们的研究 发现出血性血小板病患者 GPⅠb 低下，这就进一步启迪我们，该病发病机理可能与凝 血酶受体异常有关。 凝血酶是一个多功能血浆丝氨酸蛋白酶，它能活化血小板使之发生聚集。GPⅠb/ Ⅸ / Ⅴ复合物是血小板表面的重要膜糖蛋白，能与凝血酶结合，在血小板粘附及聚集过程 中起重要作用，长期以来被普遍认为是凝血酶受体。GPⅠb/ Ⅸ/ Ⅴ包括 4 种成分：GP Ⅰbα、GPⅠbβ、GP Ⅸ、GPⅤ。很多资料表明，凝血酶高亲和力结合位点于 GPⅠb α，GPⅤ对凝血酶高亲和力结合位点形成有重要作用。近年来研究发现血小板表面还 存在一类重要的凝血酶受体，即 PARs (protease-activated receptors)，凝血酶的细胞反应 可部分地通过这一个 G 蛋白偶连受体的小家族介导进行信号传递，这一家族包括 PARl、 PAR2、PAR3 与 PAR4 四大成员。通常凝血酶反应由一个以上 PARs 受体介导，切割其 特定位点暴露新的氨基末端，从而形成一个固定配基与受体进行分子内结合，影响跨膜 信号传导。人类血小板表达 PARl 与 PAR4 受体，它们都能与 G12/13、Gq 家族偶连，并 通过分泌 ADP 引起 P2Y12 受体活化而间接激活 Gi 信号途径，引起血小板聚集、释放 以及膜糖蛋白的一系列改变。PARl 具有高亲和力，低浓度凝血酶即诱导其活化，产生 快速、强劲的血小板反应。PAR4 则亲和力较低，作用弱于 PARl，由高浓度凝血酶活化， 可以成为 PARl 途径的补充。PARs 受体的研究在国内尚刚起步，而国际上正成为热点。 因此进行凝血酶与血小板相互作用的研究，对于深刻了解出血性疾病的发病机制的机理 非常重要。 本项目根据我们十余年来对出血性血小板病研究的初步结果及中医药治疗的疗效
国家自然科学基金申请 结合国内、外专家理论,认为不论何种诱导剂引起血小板聚集反应的途径如何,其前提 是血小板活化,凝血酶是最强的血小板活化剂,其可以调节血小板聚集、释放与内皮细 胞活化。因此研究血小板表面凝血酶受体功能对于出血与止血研究至关重要。而我们所 见的病例中多有GPIb-I复合物含量减低的,故初步推想这类出血性疾病可能是一组凝 血酶受体功能异常所致。而益气活血中药治疗该病的疗效机理之一,可能与调节凝血酶 受体存在一定关联。因此本课题拟用相应的单克隆抗体,流式细胞术及分子生物学等现 代新技术,研究本病中药治疗前后血小板活化过程的形态改变、聚集以及凝血酶受体的 动态变化过程,并分析这些活化过程中细胞骨架蛋白的改变,拟进一步从分子和受体水 平丰富出血性血小板病的病理实质及中药治疗的疗效机理。 主要参考文献 1. Shen di, Wei Wenning, Wang Ailian;etal. A new variant of沈迪,魏文宁,王辨明,等.一组 新型血小板聚集功能缺陷的初步研究.中华内科杂志.1984,23(11):669-670 2.沈迪,朱闽,王爱莲,等未明原因多部位出血者血小板聚集功能的硏究.血栓与止血学杂 1996,3(4):145-146 3.沈迪,沈霖,王爱莲,等脾不统血证146例血小板聚集功能的硏究.中国中西医结合消化杂 志,2001,9(2):68-70 4.沈迪,沈霖,王爱莲,等.消瘀片治疗新型血小板聚集功能缺陷的临床硏究中国中西医结合 杂志1994,14(10):589-591 5. Shen Di, Shen Lin, Wang A L, et al. Clinical observation on effect of Xiaoyu Zhixue tablet on 104 patients with idiopathic multifocal bleeding and platelet aggregation defect. CJIM. 1998, 4(4): 247-250 6. Shen Lin, Shen Lin, Gao Lan, et al. Effect of Xiaoyu Zhixue tablet on expression of platelet membrane glycoproteins in patients with hemorrhageic thrombopathy. CJIM. 2004, 10(3): 170-174 7.沈霖,沈迪,杨胜兰,等.健脾益气活血方治疗脾不统血併血小板聚集缺陷症疗效观察.中国 中西医结合消化杂志.2005,13(2):80-82 8. Soslau G, Class R, Morgan DA, et al. Unique pathway of thrombin-induced platelet aggregation mediated by glycoprotein Ib. J Biol Chem, 2001, 276: 21173-83 9. Skip Brass. Platelets and proteases. Nature. 2001, 413: 26-7 10.Sambrano GR, Weiss E I, Zheng YW et al. Role of thrombin signaling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature, 2001, 413: 74-8 11. Coughlin SR. Thrombin signaling and protease-activated receptors Nature. 2001 407: 258-64 12. Chung AWY, Jurasz Paul, Hollenberg MD, et al. Mechanisms of action of proteinase activated receptor agonists on humanplatelets. Br. J. Pharmacol, 2002, 135: 1123-32 13. Kim S, Foster C, Lecchi A, et al. Protease activated receptors l and 4 do not stimulate Gi signaling pathways in the absence of secreted ADP and cause human platelet aggregation independently of gi ignaling. Blood, 2002, 99: 3629-36 第7页 版本1003.094
国家自然科学基金申请书 第 7 页 版本 1.003.094 结合国内、外专家理论，认为不论何种诱导剂引起血小板聚集反应的途径如何，其前提 是血小板活化，凝血酶是最强的血小板活化剂，其可以调节血小板聚集、释放与内皮细 胞活化。因此研究血小板表面凝血酶受体功能对于出血与止血研究至关重要。而我们所 见的病例中多有 GPIb-I 复合物含量减低的，故初步推想这类出血性疾病可能是一组凝 血酶受体功能异常所致。而益气活血中药治疗该病的疗效机理之一，可能与调节凝血酶 受体存在一定关联。因此本课题拟用相应的单克隆抗体，流式细胞术及分子生物学等现 代新技术，研究本病中药治疗前后血小板活化过程的形态改变、聚集以及凝血酶受体的 动态变化过程，并分析这些活化过程中细胞骨架蛋白的改变，拟进一步从分子和受体水 平丰富出血性血小板病的病理实质及中药治疗的疗效机理。 主要参考文献 1. Shen Di, Wei Wenning , Wang Ailian,et al. A new variant of 沈迪，魏文宁，王辨明，等.一组 新型血小板聚集功能缺陷的初步研究. 中华内科杂志.1984，23（11）：669-670 2 . 沈迪，朱闽，王爱莲，等.未明原因多部位出血者血小板聚集功能的研究. 血栓与止血学杂 志.1996，3（4）：145-146 3. 沈迪，沈霖，王爱莲，等.脾不统血证 146 例血小板聚集功能的研究. 中国中西医结合消化杂 志，2001，9（2）：68-70 4. 沈迪，沈霖，王爱莲，等.消瘀片治疗新型血小板聚集功能缺陷的临床研究.中国中西医结合 杂志.1994,14(10):589-591 5. Shen Di, Shen Lin,Wang A L,et al. Clinical observation on effect of Xiaoyu Zhixue tablet on 104 patients with idiopathic multifocal bleeding and platelet aggregation defect.CJIM.1998,4(4):247-250 6. Shen Lin, Shen Lin, Gao Lan, et al. Effect of Xiaoyu Zhixue tablet on expression of platelet membrane glycoproteins in patients with hemorrhageic thrombopathy. CJIM.2004, 10(3):170-174 7. 沈霖，沈迪，杨胜兰，等. 健脾益气活血方治疗脾不统血併血小板聚集缺陷症疗效观察. 中国 中西医结合消化杂志. 2005，13（2）:80-82 8. Soslau G，Class R，Morgan DA，et a1．Unique pathway of thrombin-induced platelet aggregation mediated by glycoprotein lb. J Biol Chem，2001，276：21173-83 9. Skip Brass．Platelets and proteases．Nature．2001，413：26-7 10.Sambrano GR，Weiss E 了，Zheng YW et a1．Role of thrombin signaling in platelets in haemostasis and thrombosis．Nature，2001，413：74-8 11. Coughlin SR．Thrombin signaling and protease- activated receptors Nature．2001 407：258-64． 12.Chung AWY，Jurasz Paul，Hollenberg MD，et a1．Mechanisms of action of proteinase activated receptor agonists on humanplatelets．Br．J．Pharmacol，2002，135：1123-32． 13. Kim S，Foster C，Lecchi A，et a1．Protease activated receptors 1 and 4 do not stimulate Gi signaling pathways in the absence of secreted ADP and cause human platelet aggregation independently of Gi signaling. Blood，2002，99：3629-36