分子生物学实验实验二质粒DNA的限制性内切酶酶切
实验二 质粒DNA的限制性内切酶酶切
实验目的了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定
一 实验目的 了解限制性内切酶作用的原理、特点和酶切质粒DNA的试验方法 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的 DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、 连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是 DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。第二类（II型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点 附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没 有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。 第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内 的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷 酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工 具酶之一。 第三类（ III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回 文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几 个核苷酸对不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定 长度DNA片段，具有各种单链末端。因此不能应用于基因克隆
二实验原理IⅡI型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端：有的在识别顺序的双侧末端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切需要Mg2+激活，大部分II型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切片断。本实验采用PMD18-T质粒具有EcoRI和Hind的识别序列和酶切位点分别为AAGCTTGAATTC和CTTAAGTTCGAA
二 实验原理 Ⅱ型酶识别的DNA序列一般含有4～6个核苷酸。有的在识别顺序 的对称轴上对双链DNA同时切割产生平末端；有的在识别顺序的双侧末 端DNA双链产生粘性末端。Ⅱ型限制性内切酶需要Mg2+激活，大部分Ⅱ 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称为回文结构。 质粒DNA通常都具有一个或多个限制性内切酶酶切识别序列，可 被相应限制性内切酶切出相应数量的切口，从而产生相应数量的酶切 片断。 本实验采用PMD18-T质粒具有EcoRⅠ和Hind的识别序列和酶切位 点分别为 GAATTC 和 AAGCTT CTTAAG TTCGAA
pMD18-T&pMD19-TVector的结构pMD18-T&pMD19-TECORVT-Cloning SiteVector(2,692 bp)pMD18-TVectorBcaBESTTM sequencing Primer RV-MGAGCGGATAACAATTTCACACAGGXmalHincIIAccI Sse8387ISmalECORISacIKpnIBamHI Xbal EcoRy SaliPstisph HindlaczGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGDigested by EcoR VCAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCBcaBESTSequencingPrimerM13-47tctagagatTatcgtcgacc.(T-Cloning Site)pMD19-TVectoragatctctaTtagcagctggBcaBESTTM sequencing Primer RV-MHinc IIGAGCGGATAACAATTTCACACAGGSse83871AccIXmallaczSa/IEcoRy Xbal BamHISmalKpnISacI EcoRIHindIISphIPstIGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGDigestedbyEcoRVCAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCBcaBESTSequencing PrimerM13-47-gtcgacgatTatctctaga(T-Cloning Site)cagctgctaTtagagatct