二维化学位移相关谱（相关谱，即correlation spectroscopy,简写为COSY)是2D-COSY谱 中最重要、也是最常用的一种测试技术。2D-COSY谱又分为同核和异核相关谱两种。相关 谱的二维坐标F和F2都表示化学位移。在中药有效成分结构研究中常用的相关谱类型如下。 ①同核化学位移相关谱H-'H COSY也称氢-氢化学位移相关谱，是同一个偶合体系中 质子之间的偶合相关谱。可以确定质子化学位移以及质子之间的偶合关系和连接顺序。图谱 多以等高线图表示。对角线上的峰为一维谱，对角线两边相应的交叉峰与对角线上的峰连成 正方形，该正方形对角线上的两峰即表示有偶合相关关系。例如，在化合物3.4-二轻基苯乙 醇-8-O-B-D-葡萄糖苷(3,4-dihydroxyphenylethyl-8-O-B-D-glucopyranoside)的'H-'H COSY(图 2-13)谱中可见苷元苯乙醇的7-H(62.65)与8-H(63.90,3.65)有交叉峰。此外，在'H-'HC0SY 谱能找到葡萄糖基上氢与氢的偶合关系。 ②H检测的异核化学位移相关谱异核化学位移相关谱特别是C-H COSY谱，对于鉴 定化合物的结构是十分重要的方法，常用的有HMQC谱和HMBC谱。 HMQC谱是通过H核检测的异核多量子相关谱(H detected heteronuclear multiple quantum coherence, 简称HMQC),此谱能反映'H核和与其直接相连的3C的关联关系，以确 定C-H偶合关系(JcH)。在HMQC谱中，F域为3C℃化学位移，F2域为'H化学位移。直接相 连的3℃与H将在对应的3℃和H化学位移的交点处给出相关信号。由相关信号分别沿两轴画 平行线，就可将相连的13℃与H信号予以直接归属。例如，在3,4-二羟基苯乙醇-8-0-B-D-葡 萄糖苷的HMQC谱（图2-14）中，可找到各碳、氢的相关峰，由此可容易确定各碳氢的归 属。 HMBC谱是通过'H核检测的异核多键相关谱(H detected heteronuclear multiple bond correlation,简称HMBC),它把'H核和与其远程偶合的l3c核关联起来。在HMBC谱中，F域 为3℃化学位移，F2域为'H化学位移，HMBC可以高灵敏地检测'H-13C远程偶合(JcH.n≥2)， 通过2~3个键的质子与季碳的偶合也有相关峰。从HBMC谱中可得到有关碳链骨架的连接信 息、有关季碳的结构信息及因杂原子存在而被切断的偶合系统之间的结构信息。例如在化合 物异甘草素-4-O-芹糖(2→l)葡萄糖苷(isoliquiritigenin4-O-β-apiofuranosyl(2-→1)B- glucopyranoside)的HMBC谱（图2-15）中可见葡萄糖1"-H与异甘草素苷元C-4(⑧160.9)的相关 峰，芹糖1-H"(65.51)与C-3"(680.7)、C-2"(678.2)、C-5"'(675.5)及葡萄糖C-2"(878.2)有相 关峰。由此可确定葡萄糖与异甘草素苷元B环的4位相连，芹糖与葡萄糖的2"位相连。 OH HO 0 CH,OH HO OH 3,4-二羟基苯乙醇-8-0-B-D-葡萄糖苷 异甘草素-4-0-芹糖(2→1)葡萄糖苷 19
二维化学位移相关谱(相关谱，即correlation spectroscopy，简写为COSY)是 2D-COSY谱 中最重要、也是最常用的一种测试技术。2D-COSY谱又分为同核和异核相关谱两种。相关 谱的二维坐标Fl和F2都表示化学位移。在中药有效成分结构研究中常用的相关谱类型如下。 ① 同核化学位移相关谱 l H-1 H COSY也称氢-氢化学位移相关谱，是同一个偶合体系中 质子之间的偶合相关谱。可以确定质子化学位移以及质子之间的偶合关系和连接顺序。图谱 多以等高线图表示。对角线上的峰为一维谱，对角线两边相应的交叉峰与对角线上的峰连成 正方形，该正方形对角线上的两峰即表示有偶合相关关系。例如，在化合物 3,4-二羟基苯乙 醇-8-O-β-D-葡萄糖苷（3,4-dihydroxyphenylethyl-8-O-β-D-glucopyranoside）的1 H-1 H COSY（图 2-13）谱中可见苷元苯乙醇的 7-H(δ2.65) 与 8-H(δ3.90，3.65)有交叉峰。此外，在1 H-1 H COSY 谱能找到葡萄糖基上氢与氢的偶合关系。 ② 1 H检测的异核化学位移相关谱 异核化学位移相关谱特别是13C-l H COSY谱，对于鉴 定化合物的结构是十分重要的方法，常用的有HMQC谱和HMBC谱。 HMQC谱是通过l H核检测的异核多量子相关谱( l H detected heteronuclear multiple quantum coherence，简称HMQC), 此谱能反映 l H核和与其直接相连的13C的关联关系，以确 定C-H偶合关系（1 JCH）。在HMQC谱中，Fl域为13C化学位移，F2域为l H化学位移。直接相 连的13C与l H将在对应的13C和l H化学位移的交点处给出相关信号。由相关信号分别沿两轴画 平行线，就可将相连的13C与l H信号予以直接归属。例如，在 3,4-二羟基苯乙醇-8-O-β-D-葡 萄糖苷的HMQC谱（图 2-14）中，可找到各碳、氢的相关峰，由此可容易确定各碳氢的归 属。 HMBC谱是通过l H核检测的异核多键相关谱( l H detected heteronuclear multiple bond correlation，简称HMBC)，它把l H核和与其远程偶合的13C核关联起来。在HMBC谱中， Fl域 为13C 化学位移，F2域为1 H化学位移, HMBC可以高灵敏地检测1 H-13C远程偶合( n JCH，n≧2)， 通过 2~3 个键的质子与季碳的偶合也有相关峰。从HBMC谱中可得到有关碳链骨架的连接信 息、有关季碳的结构信息及因杂原子存在而被切断的偶合系统之间的结构信息。例如在化合 物异甘草素-4-O-芹糖(2→1)葡萄糖苷(isoliquiritigenin4-O-β-apiofuranosyl(2→1)-β- glucopyranoside)的HMBC谱(图 2-15)中可见葡萄糖 1″-H与异甘草素苷元C-4(δ160.9)的相关 峰，芹糖１-H″′(δ5.51)与C-3″′(δ80.7)、C-2″′(δ78.2)、C-5″′ (δ75.5)及葡萄糖C-2"(δ78.2)有相 关峰。由此可确定葡萄糖与异甘草素苷元B环的 4 位相连，芹糖与葡萄糖的 2"位相连。 HO O O HO O HO OH CH2OH H O OH O OH OH O OH OH OH HO 1 2 3 4 5 6 7 8 1' 2' 3' 4' 5' 6' 2 4 6 5 2' 3' 4' 5' 6' HO O OH H 3 1"' 1" 3,4-二羟基苯乙醇-8-O-β-D-葡萄糖苷 异甘草素-4-O-芹糖(2→1)葡萄糖苷 19
1 8a8%352 5 6 ppm ppm .6 2 图2-133,4二羟基苯乙醇-8-0-邛-D-葡萄糖苷的H'HC0SY谱 256 8a 动3527 40 60 C3,5 100 C2.5 C6 E140 f ppm ppm 6 4 3 2m 图2-143,4二羟基苯乙醇-8-0-邛-D-葡萄糖苷的HMQC谱 20
图 2-13 3,4-二羟基苯乙醇-8-O-β-D-葡萄糖苷的1 H-1 H COSY谱 图 2-14 3,4-二羟基苯乙醇-8-O-β-D-葡萄糖苷的 HMQC 谱 20
10 6 140 0 图2-15异甘草素-4-0-芹糖(2→1)葡萄糖苷的HMBC图谱 4.MS 随着现代分析技术的飞速发展，近年来，新的离子源不断出现，使质谱在确定化合物分 子量、元素组成和由裂解碎片检测官能团、辨认化合物类型、推导碳骨架等方面发挥着重要 作用。如用质谱法进行糖苷结构的测定，可以获得有关糖苷分子量、苷元结构、糖基序列等 信息（见图2-16）。以下是主要离子源的电离方式及相应的特点。 (1)电子轰击质谱(electron impact mass spectrometry EI.-MS) 在电子轰击条件下，大多数分子电离后生成缺一个电子的分子离子，并可以继续发生键 的断裂形成“碎片”离子。这对推测化合物结构十分有用。但当样品相对分子质量较大或对 热稳定性差时，常常得不到分子离子，因而不能测定这些样品的相对分子质量。 (2)化学电离质谱(chemical ionization mass spectrometry CI--MS) 通过引入大量的试剂气体产生的反应离子与样品分子之间的离子分子反应，使样品分 子实现电离。利用化学电离源，即使是不稳定的化合物，也能得到较强的准分子离子峰，即 M士1峰，从而有利于确定其分子量。但此法的缺点是碎片离子峰较少，可提供的有关结构 方面信息少。 (3)场解吸质谱(field desorption mass spectrometry FD-MS) 将样品吸附在作为离子发射体的金属丝上送入离子源，只要在细丝上通以微弱电流，提 供样品从发射体上解吸的能量，解吸出来的样品即扩散到高场强的场发射区域进行离子化。 FD-MS特别适用于难气化和热稳定性差的固体样品分析，如有机酸、甾体类、糖苷类、生物 碱、氨基酸、肽和核苷酸等。此法的特点是形成的M广没有过多的剩余内能，减少了分子离 子进一步裂解的概率，增加了分子离子峰的丰度，碎片离子峰相对减少。因此用于极性物质 的测定，可得到明显的分子离子峰或M+1]广峰，但碎片离子峰较少，对提供结构信息受到一 21
图 2-15 异甘草素-4-O-芹糖(2→1)葡萄糖苷的 HMBC 图谱 4．MS 随着现代分析技术的飞速发展，近年来，新的离子源不断出现，使质谱在确定化合物分 子量、元素组成和由裂解碎片检测官能团、辨认化合物类型、推导碳骨架等方面发挥着重要 作用。如用质谱法进行糖苷结构的测定，可以获得有关糖苷分子量、苷元结构、糖基序列等 信息（见图 2-16）。以下是主要离子源的电离方式及相应的特点。 （1）电子轰击质谱(electron impact mass spectrometry EI-MS) 在电子轰击条件下，大多数分子电离后生成缺一个电子的分子离子，并可以继续发生键 的断裂形成“碎片”离子。这对推测化合物结构十分有用。但当样品相对分子质量较大或对 热稳定性差时，常常得不到分子离子，因而不能测定这些样品的相对分子质量。 （2）化学电离质谱(chemical ionization mass spectrometry CI-MS) 通过引入大量的试剂气体产生的反应离子与样品分子之间的离子-分子反应，使样品分 子实现电离。利用化学电离源，即使是不稳定的化合物，也能得到较强的准分子离子峰，即 M±1 峰，从而有利于确定其分子量。但此法的缺点是碎片离子峰较少，可提供的有关结构 方面信息少。 （3）场解吸质谱（field desorption mass spectrometry FD-MS） 将样品吸附在作为离子发射体的金属丝上送入离子源，只要在细丝上通以微弱电流，提 供样品从发射体上解吸的能量，解吸出来的样品即扩散到高场强的场发射区域进行离子化。 FD-MS特别适用于难气化和热稳定性差的固体样品分析，如有机酸、甾体类、糖苷类、生物 碱、氨基酸、肽和核苷酸等。此法的特点是形成的M+ 没有过多的剩余内能，减少了分子离 子进一步裂解的概率，增加了分子离子峰的丰度，碎片离子峰相对减少。因此用于极性物质 的测定，可得到明显的分子离子峰或[M+1]+ 峰，但碎片离子峰较少，对提供结构信息受到一 21
些局限。为提高灵敏度可加入微量带阳离子K、Na等碱金属化合物于样品中，可产生明显 的准分子离子峰、[M+Na广、[M+K广和碎片离子峰。 (4)快原子轰击质谱(fast atom bombardment mass spectrometry FAB-MS)和液体二次离 子质谱((liquid secondary ion mass spectrometry LSI-MS) 是以高能量的初级离子轰击表面，再对由此产生的二次离子进行质谱分析。这两种技术 均采用液体基质（如甘油）负载样品，其差异仅在于初级高能量粒子不同，前者使用中性原 子束，后者使用离子束。样品若在基质中的溶解度小，可预先用能与基质互溶的溶剂（如甲 醇、乙腈、HO、DMSO、DMF等)溶解，然后再与基质混匀。此方法常用于大分子极性化 合物特别是对于糖苷类化合物的研究。除得到分子离子峰外，还可得到糖和苷元的结构碎片 峰，从而弥补了FD-MS的不足。 (5)基质辅助激光解吸电离质谱(matrix-assisted laser desorption mass spectrometry MALDI-MS) 是将样品溶解于在所用激光波长下有强吸收的基质中，利用激光脉冲辐射分散在基质中 的样品使其解离成离子，并根据不同质核比的离子在仪器无场区内飞行和到达检测器时间， 即飞行时间的不同而形成质谱。此种质谱技术适用于结构较为复杂、不易气化的大分子如多 肽，蛋白质等的研究，可得到分子离子、准分子离子和具有结构信息的碎片离子。 (6)电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry ESI-MS) 是一种使用强静电场的电离技术，既可分析大分子也可分析小分子。对于分子量在1000 Da以下的小分子，会产生M+H或[M一H田离子，选择相应的正离子或负离子形式进行检 测，就可得到物质的分子量。而分子量高达20,000Da的大分子会生成一系列多电荷离子， 通过数据处理系统能得到样品的分子量。 (7)串联质谱(tenden mass spectrometry MS-MS) 串联质谱可简表为MSMS,随着串联级数的增加进而表示为MS",其中n表示串联级数。 这是一种用质谱作质量分离的质谱技术。它可以研究母离子和子离子的关系，获得裂解过程 的信息，用以确定前体离子和产物离子的结构。近年，国内亦有将此技术用于鉴定中药有效 部位中的各种成分的化学结构的研究报道。从一级M$中得到有效部位中各成分的分子离子， 再通过对各个分子离子进行二级至三级质谱分析，从而实现对有效部位中各种成分在未加分 离的情况下分别进行鉴定的目的。 (411) 30 429 46 k 图2-16某糖苷(a)的FAB-MS谱，(b)(M+H)CAD谱 22
些局限。为提高灵敏度可加入微量带阳离子K+ 、Na+ 等碱金属化合物于样品中，可产生明显 的准分子离子峰、[M+Na]+ 、[M+K]+ 和碎片离子峰。 （4）快原子轰击质谱(fast atom bombardment mass spectrometry FAB-MS)和液体二次离 子质谱(liquid secondary ion mass spectrometry LSI-MS) 是以高能量的初级离子轰击表面，再对由此产生的二次离子进行质谱分析。这两种技术 均采用液体基质（如甘油）负载样品，其差异仅在于初级高能量粒子不同，前者使用中性原 子束，后者使用离子束。样品若在基质中的溶解度小，可预先用能与基质互溶的溶剂(如甲 醇、乙腈、H2O、DMSO、DMF等)溶解，然后再与基质混匀。此方法常用于大分子极性化 合物特别是对于糖苷类化合物的研究。除得到分子离子峰外，还可得到糖和苷元的结构碎片 峰，从而弥补了FD-MS的不足。 （5）基质辅助激光解吸电离质谱（matrix-assisted laser desorption mass spectrometry MALDI-MS） 是将样品溶解于在所用激光波长下有强吸收的基质中，利用激光脉冲辐射分散在基质中 的样品使其解离成离子，并根据不同质核比的离子在仪器无场区内飞行和到达检测器时间， 即飞行时间的不同而形成质谱。此种质谱技术适用于结构较为复杂、不易气化的大分子如多 肽，蛋白质等的研究，可得到分子离子、准分子离子和具有结构信息的碎片离子。 （6）电喷雾电离质谱 (electrospray ionization mass spectrometry ESI-MS) 是一种使用强静电场的电离技术，既可分析大分子也可分析小分子。对于分子量在 1000 Da以下的小分子，会产生[M + H]+ 或[M－H]－ 离子，选择相应的正离子或负离子形式进行检 测，就可得到物质的分子量。而分子量高达 20，000Da的大分子会生成一系列多电荷离子， 通过数据处理系统能得到样品的分子量。 （7）串联质谱（tenden mass spectrometry MS-MS） 串联质谱可简表为MS/MS，随着串联级数的增加进而表示为MSn ，其中n表示串联级数。 这是一种用质谱作质量分离的质谱技术。它可以研究母离子和子离子的关系，获得裂解过程 的信息，用以确定前体离子和产物离子的结构。近年，国内亦有将此技术用于鉴定中药有效 部位中的各种成分的化学结构的研究报道。从一级MS中得到有效部位中各成分的分子离子， 再通过对各个分子离子进行二级至三级质谱分析，从而实现对有效部位中各种成分在未加分 离的情况下分别进行鉴定的目的。 图 2-16 某糖苷(a)的 FAB-MS 谱, (b) (M+H)CAD 谱 22
5.旋光光谱(ORD)和圆二色光谱(CD) 旋光光谱(optical rotatory dispersion ORD)和圆二色光谱(circular dichroism CD)在测 定手性化合物的构型和构象、确定某些官能团（如羰基）在手性分子中的位置方面有独到之 处，是其他波谱难以代替的。 (1)旋光光谱用不同波长(200~760m)的偏振光照射光学活性化合物，并用波长对 比旋光度[ā]或摩尔旋光度[中]作图所得的曲线即旋光谱。常见的类型如下。 ①平坦谱线没有发色团的光学活性化合物，其旋光谱是平坦的，没有峰和谷。比旋 光度向短波处升高的谱形是正性谱线（图2-17A),向短波处降低的谱形是负性谱线（图2-17 B)。谱形的正负性与旋光值的正负无关。 A 2 300 400 500 600 波长(m) 图2-17平坦谱线 A.正性B.负性 ②Cottor谱线化合物分子手性中心邻近有发色团，在发色团吸收波长区域附近，旋 光度发生显著变化，产生峰和谷的现象称为Cotton效应，所绘制的谱图称为Cotton谱线。谱 线中只有一个峰和谷的称为单纯Cotton谱线，有数个峰和谷的称复合Cotton谱线。图2-l8为 胆甾酮（△'-cholestenone)的Cotton谱线。波长短波方向为谷，长波方向为峰的为正性Cotton 效应，相反则为负Cottor效应。由图2-18可知A、B二个化合物结构式相同，但绝对构型不 同。 Cotton(+) (A 250 300 350.- 400 (nm） Cotton(-) '(B) 图2-18△5.胆甾酮的Cotton谱线 实线(A)天然胆甾酮(+)Cotton 虚线(B)绝对构型相反的胆甾酮(-)Cotton (2)园二色谱旋光性化合物对组成平面偏振光的左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的摩尔 吸光系数是不同的，这种现象称之为圆二色性。两种摩尔吸光系数之差△C=CL一CR,随入射 23
5．旋光光谱(ORD)和圆二色光谱(CD) 旋光光谱（optical rotatory dispersion ORD）和圆二色光谱（circular dichroism CD）在测 定手性化合物的构型和构象、确定某些官能团（如羰基）在手性分子中的位置方面有独到之 处，是其他波谱难以代替的。 (1) 旋光光谱 用不同波长（200~760nm）的偏振光照射光学活性化合物，并用波长对 比旋光度[α]或摩尔旋光度[φ]作图所得的曲线即旋光谱。常见的类型如下。 ① 平坦谱线 没有发色团的光学活性化合物，其旋光谱是平坦的，没有峰和谷。比旋 光度向短波处升高的谱形是正性谱线（图 2-17A），向短波处降低的谱形是负性谱线(图 2-17 B)。谱形的正负性与旋光值的正负无关。 图 2-17 平坦谱线 A. 正性 B. 负性 ② Cotton 谱线 化合物分子手性中心邻近有发色团，在发色团吸收波长区域附近，旋 光度发生显著变化，产生峰和谷的现象称为Cotton效应，所绘制的谱图称为Cotton谱线。谱 线中只有一个峰和谷的称为单纯Cotton谱线，有数个峰和谷的称复合Cotton谱线。图 2-18 为 胆甾酮(△5 -cholestenone)的Cotton谱线。波长短波方向为谷，长波方向为峰的为正性Cotton 效应，相反则为负Cotton效应。由图 2-18 可知A、B二个化合物结构式相同，但绝对构型不 同。 图 2-18 △5 - 胆甾酮 的Cotton谱线 实线（A） 天然胆甾酮(+)Cotton 虚线（B） 绝对构型相反的胆甾酮(-)Cotton （2）园二色谱 旋光性化合物对组成平面偏振光的左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的摩尔 吸光系数是不同的，这种现象称之为圆二色性。两种摩尔吸光系数之差Δє＝єL－єR，随入射 23