第二节双脱氧链终止法 1977年Sanger充分利用DNA复制的生物学特性， 设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法， 进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。 Sanger法获得诺贝尔化学奖。 周 11/92
11/92 第二节 双脱氧链终止法 ▪ 1977年Sanger充分利用DNA复制的生物学特性， 设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法， 进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。 ▪ Sanger法获得诺贝尔化学奖
一、原理 该方法巧妙的利用了DNA复制过程和ddNTP的特点。 ◆在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3'- OH末端使引物延长合成出新的互补的DNA链，如果加 入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),会引起互补链的合成终 止； ◆当使用四组ddNTP进行反应时，由于双脱氧核苷酸在 每个DNA分子中掺入的位置不同，形成一种全部具有 相同5'.引物端和以ddNMP:残基为3'端结尾的一系列长 短不一片段的混合物； ◆采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链 DNA,从而读取DNA核苷酸序列。 12/92
12/92 一、原 理 该方法巧妙的利用了DNA复制过程和ddNTP的特点。 ◆在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’- OH末端使引物延长合成出新的互补的DNA链，如果加 入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，会引起互补链的合成终 止； ◆当使用四组ddNTP进行反应时，由于双脱氧核苷酸在 每个DNA分子中掺入的位置不同，形成一种全部具有 相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长 短不一片段的混合物； ◆采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链 DNA，从而读取DNA核苷酸序列
Base Base Base OH OH OH H Ribonucleoside Deoxyribonucleoside Dideoxyribonucleoside triphosphate triphosphate triphosphate (NTP) (dNTP) (ddNTP) =P-P- Base H H Cannot form a phosphodiester bond with next incoming dNTP
13/92
11 Base Base HC C ch H Ligase H + H2O 0 5 CH2 Base 0 CH Base HC C HC 3 CH OH H HC CH 双脱氧核苷酸？ OH H Phosphodiester bond
14/92 14/95 双脱氧核苷酸. ? HH H H
由于双脱氧核糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后 续的dNTP形成磷酸二酯键。 碱基 H 刷 P 碱基 OH 15/92
15/92 O 碱基 P C H H 1 3 2 4 5 O 碱基 P C OH H 1 3 2 4 5 XOH 由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后 续的dNTP形成磷酸二酯键