3, ATGCGGTACCAT 5测序模板 TA TACGCCA 第一套反应 5 TACGCCATGGTA 52 C 52 第二套反应 :: 图 1-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.ddATP 四套反应体系 2-dATP,dCTP.dGTP dTTP.+ddCTP 3-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.ddGTP 4-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.ddTTP 16/92
16/92 四 套 反 应 体 系 1-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP 2-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP 3-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP 4-dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP 3’ ATGCGGTACCAT 5’测序模板 5’ TA 5’ TACGCCA 5’ TACGCCATGGTA C C C 第一套反应 第二套反应 5’ 5’ 5’
G 圈 思 HO0H4 UUOUIH 周 5'TACGCCATGGTA 171/92
17/92 A C G T T A C G C C A T G G T A 5’TACGCCATGGTA
二、基本步骤 ◆模板的制备和引物设计 ◆模板变性、退火、标记、延伸和终止、 电泳分析、数据读取。 圈 圈 18/92
18/92 二、基本步骤 ◆模板的制备和引物设计 ◆模板变性、退火、标记、延伸和终止、 电泳分析、数据读取
1、模板和引物 (1)、模板 纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA都可以用 作Sanger法测定的模板。模板的质量和所用的DNA聚合 酶的种类是至关重要的。 通常采用MM3噬菌体颗粒分离到的单链DNA模板效果最佳，用变性 双链DNA作模板则难获此效果。小量制备质粒DNA常被寡核苷酸小 分子，核糖核苷酸及DNA聚合酶抑制剂所污染，前两者可被用作随 机引物，造成假象和强终止现象，使测序胶含糊不清。 19/92
19/92 1、模板和引物 （1）、模板 纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA都可以用 作Sanger法测定的模板。模板的质量和所用的DNA聚合 酶的种类是至关重要的。 通常采用M13噬菌体颗粒分离到的单链DNA模板效果最佳，用变性 双链DNA作模板则难获此效果。小量制备质粒DNA常被寡核苷酸小 分子，核糖核苷酸及DNA聚合酶抑制剂所污染，前两者可被用作随 机引物，造成假象和强终止现象，使测序胶含糊不清
(2) 引物 酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核 苷酸作为DNA合成的引物。 在许多情况下可将靶DNA片段克隆于M3噬菌体或噬菌粒载体，以取 得单链DNA分子作为模板。也可用Sanger法测定变性双链DNA模板序 列（如变性质粒DNA)。以上两种情况都可以采用能与位于靶DNA侧 翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与未知DNA序列互补的引 物。 M13噬菌体重组子的通用测序引物一般长15-29bp,与紧靠M13mp18 多克隆位点区的Hindlll或MM3mp19多克隆位点区EcoRI位点的序列互 补。这些引物同样也可用于PUC质粒的DNA进行“双链”测序，并且 已经商品化。 20/92
20/92 （2）引物 酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核 苷酸作为DNA合成的引物。 在许多情况下可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载体，以取 得单链DNA分子作为模板。也可用Sanger法测定变性双链DNA模板序 列（如变性质粒DNA）。以上两种情况都可以采用能与位于靶DNA侧 翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与未知DNA序列互补的引 物。 M13噬菌体重组子的通用测序引物一般长15-29bp，与紧靠M13mp18 多克隆位点区的HindIII或M13mp19多克隆位点区EcoRI位点的序列互 补。这些引物同样也可用于PUC质粒的DNA进行“双链”测序，并且 已经商品化