5 CGCCGTCATG-3 Label 5'end with 32p 5 32P-CGCCGTCATG3 Cleave Cleave Cleave Cleave atG's atA's&G's atC's&Ts at C's Direction of electrophoresis 3 P-CGCCGTCATG 10 G 9 T A 7 6 T 32P-CGCCG 5 4 c 3 sp -cG} 2 G 1 c Autoradiogram Fragment Deduced length sequence in bases Figure 3-48 The Maxam-Gilbert Chemical Cleavage Method for Sequencing DNA In tbis procedure.four different cbemi cal reagents are employed to cleave single-stranded DNA cbains adjacent to particular bases.The radiouctive fragments are tben separated on the basis of size by gel electropboresis (page 145).wbicb allous the sequential arrangement of bases in the original DNA molecule to be determined.The autoradiogram on the left shows ubat such gels look like.The diagram illus trates the banding pattern that would be observed for a DNA molecule wbose sequence is CGCCGTCATG read in the 53 direction.To belp sbow ubat sucb gel patterns mean,the sequences of tbe tbree fragments produced by the reagent that cleaves adjacent to G residues are provided at the left of tbe diagram
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三、化学修饰试剂 ◆G反应-硫酸二甲酯（DMS)使GN7甲基化，被修饰鸟 嘌呤与核糖的结合下降。 ◆G+A反应-哌啶甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了 腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键， 使DNA发生断裂。 ◆T+C反应-碱性条件下，肼断开了嘧啶环，使DNA断裂。 ◆C反应-在NaCI存在时，只有C才能与肼发生反应。 7/92
7/92 ◆G反应-硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，被修饰鸟 嘌呤与核糖的结合下降。 ◆G+A反应-哌啶甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了 腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键， 使DNA发生断裂。 ◆T+C反应-碱性条件下，肼断开了嘧啶环，使DNA断裂。 ◆C反应-在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应。 三、化学修饰试剂
化学试剂及化学反应表 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 G和A C+T 肼 嘧啶开环 C和T 肼（加盐) 胞嘧啶开环 8/92
8/92 化学试剂及化学反应表 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 G和A C+T 肼 嘧啶开环 C和T C 肼（加盐） 胞嘧啶开环 C
四、化学降解法的特点 重现性好，所用试剂简单，易于掌握； 所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个 核苷酸以内的DNA序列效果较好； 序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝； 因此，不会出现误读、可对未克隆的片段、合成的寡核 苷酸直接进行测序； 5和3端均可标记，可从两方向测同一DNA,保证准确 性； ■ 操作繁琐、费时、分辨率较低、试剂毒性大。 9/92
9/92 四、化学降解法的特点 ▪ 重现性好，所用试剂简单，易于掌握； ▪ 所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记末端250个 核苷酸以内的DNA序列效果较好； ▪ 序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所生成的拷贝； 因此，不会出现误读、可对未克隆的片段、合成的寡核 苷酸直接进行测序； ▪ 5 ′和3 ′端均可标记，可从两方向测同一DNA，保证准确 性； ▪ 操作繁琐、费时、分辨率较低、试剂毒性大
ACGT 5'端标记 试分析其序列 ACCGAAAGACCCAGGATCGCCA 圈 10/92
10/92 A C G T 试分析其序列 ACCGAAAGACCCAGGATCGCCA.GCCC5‘ 5’端标记