重物 玻板纸巾 BMM 凝胶y转移校酸时不 NCE 纸巾 玻璃 i毛细管法( Capillary blotting method) 重物 玻板纸巾 NCF Southern 玻板 ←凝滤纸 印迹 缓冲液 6×SSC 支撑物
ii. 毛细管法(Capillary blotting method ) 纸巾 3MM NCF 凝胶 NCF 3MM 纸巾 玻璃 转移核酸时不需 浸在缓冲液中 重物 玻板 纸巾 3MM NCF 凝胶 重物 玻板 滤纸 缓冲液 6×SSC 支撑物 玻板 Southern 印迹
i转移法( electro blotting 多孔支撑物 凝胶 缓冲液储槽 凝胶 多孔分离器 骨架(支撑用) 缓冲液收集槽 NCE 3MM滤纸 iv.真空转移法( Vaccum blotting) 转移速度与凝胶的速度和厚度成反比,在相同转移率 (50%)时,真空法比毛细管法快13倍,其损失仅6%,而毛 细管法损失率20
iii. 电转移法 (electro blotting ) 凝胶 3MM滤纸 - + 缓冲液储槽 滤纸 NCF 凝胶 多孔分离器 骨架(支撑用) 缓冲液收集槽 iv. 真空转移法(Vaccum bllotting ) 转移速度与凝胶的速度和厚度成反比，在相同转移率 （50%）时，真空法比毛细管法快13倍，其损失仅6%，而毛 细管法损失率20%
v.各种转移方法的比较 )扩散法和毛细管法:操作简便,不需要特殊转移仪器, 但转移效率低,(扩散法为70%,毛细管法80%)耗时多。 i)电转移法:效率高,耗时少,需特殊转移仪,对转移条 件要求较严。 ⅲ真空转移法:效率高,耗时最少,需特殊真空转移仪。 vi.转移的最佳条件 i)固定基质的选择 )转移前预处理:DNA和RNA分子变性,蛋白质则需除去 凝胶中的SDS。 il分子的转移 对于分子量较大的DNA片段,必须进行原位断裂后再进行 转移,断裂DNA分子最佳长度为1-2kb
v. 各种转移方法的比较 i) 扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器， 但转移效率低,（扩散法为70%，毛细管法80%）耗时多。 ii) 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条 件要求较严。 iii) 真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。 vi. 转移的最佳条件 i) 固定基质的选择 ii) 转移前预处理：DNA和RNA分子变性，蛋白质则需除去 凝胶中的SDS。 iii)大分子的转移 对于分子量较大的DNA片段，必须进行原位断裂后再进行 转移，断裂DNA分子最佳长度为1-2kb
其步骤是:025MHCl处理凝胶两次(每次15分钟)→水洗 →0.5 MNaOH/ IM Nac两次,每次15分钟→转移。 对于大分子蛋白质,可采用下述三种方法之 解偶联剂使凝胶解聚;蛋白酶作用;转移缓冲液中加入SDS。 脱氧核苷一P0-P0-POH 标记探针的制备 (或核苷 1.标记化合物的种类 腺苷一P-0-P-POH OH OHOH 1)放射性同位素标记物 125,H,1C用于蛋白质标 脱氧核苷--0--0POH 3SH OH 记;32P,3H,3用于核 酸标记,其中32P和3S使用 CH=CH-CH -NH-C(CH) 频率高。32P标记核苷酸的a 位或γ位,3S则是标记核苷 0、c1-0-}-00-P-om 酸的位 OHOH OH
其步骤是：0.25M HCl处理凝胶两次（每次15分钟）→水洗 →0.5M NaOH/1M NaCl两次，每次15分钟→转移。 对于大分子蛋白质，可采用下述三种方法之一： 解偶联剂使凝胶解聚；蛋白酶作用；转移缓冲液中加入SDS。 三. 标记探针的制备 1. 标记化合物的种类 1）放射性同位素标记物 125I， 3H， 14C用于蛋白质标 记；32P， 3H， 35S 用于核 酸标记，其中32P和35S使用 频率高。32P标记核苷酸的α 位或γ位，35S则是标记核苷 酸的α位. 脱氧核苷 P-O-P-O-P-OH 脱氧核苷 (或核苷) P-O-P- -OH 32 腺苷 P N CH=CH-CH -NH-C (CH ) - 2 2 4 O CH -O-P-O-P-O-P-OH 2
2)非放射性标记物 i.生物素 分离自蛋黄的水溶性维生素,它可以和分离自蛋清中的 种碱性蛋白一抗生物素蛋白牢固地结合。每个抗生物素蛋白可 结合4个生物素分子。此外,链霉菌抗生蛋白与生物素结合更 牢固,可大大提高其灵敏度。 生物素可以经过化学法与不同的化合物结合形成标记化合 物 i.,半抗原 包括汞,2-乙酰胺二苯丙茂,地高辛配体和金属铕。 地高辛配体是一种脂质半抗原,可将其连在dUTP上,然后用 酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗 酶偶联物反应和显色反应
2) 非放射性标记物 i. 生物素 分离自蛋黄的水溶性维生素，它可以和分离自蛋清中的一 种碱性蛋白—抗生物素蛋白牢固地结合。每个抗生物素蛋白可 结合4个生物素分子。此外，链霉菌抗生蛋白与生物素结合更 牢固，可大大提高其灵敏度。 生物素可以经过化学法与不同的化合物结合形成标记化合 物。 ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配体和金属铕。 地高辛配体是一种脂质半抗原，可将其连在dUTP上，然后用 酶将其掺入新合成链中。检测上述标记物的方法是利用二抗- 酶偶联物反应和显色反应