优点:i用于DNA,RNA杂交分析时结果可靠,灵敏,本底低。 i用于蛋白质分析时,容量大(80μg/m2);可直接染色; 分辨率高;不需要预激活;易于操作 缺点:结合低分子蛋白质不稳定,反复使用探针次数有限(2-3 次) 2)重氮化纸:DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA,RNA和蛋白质,共价 结合,可用不同探针进行多次杂交分析。该类基质结合 生物大分子的能力差,需要激活,分析蛋白质时最好用 放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。 3)尼龙膜 阳离子尼龙膜(如zeta-prob,zeta-bind等)
优点：i. 用于DNA，RNA杂交分析时结果可靠，灵敏，本底低。 ii. 用于蛋白质分析时，容量大（80μg/cm2 )；可直接染色； 分辨率高；不需要预激活；易于操作 缺点： 结合低分子蛋白质不稳定，反复使用探针次数有限（2-3 次） 2）重氮化纸：DBM纸与DPT纤维素纸 最大特点是能结合小分子的DNA，RNA和蛋白质，共价 结合，可用不同探针进行多次杂交分析。该类基质结合 生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白质时最好用 放射性标记物。这类基质对生物大分子是主动吸附。 3) 尼龙膜 i. 阳离子尼龙膜（如Zeta-prob,Zeta-bind等）
i)容量大,蛋白质可结合480pg/cm2 i)可结合不同大小的DNA(6n),RNA和蛋白质。 i)l韧性好 iv)可用于电转移 v)可进行反复多次杂交试验 vi)广泛的化学耐受性和可高温消毒 不能用于蛋白质的直接染色。 i.)龙66 广泛用于核酸印迹分析,静电荷可从p4时阳离子状态转变 为pH7时阴离子状态,电转移时要注意 4)离子膜 i.DEAE纤维素纸(可用于sDNA, dS-DNA,RNA的制备回收) i.CM纤维素纸(可用于碱性蛋白质的结合)
i) 容量大, 蛋白质可结合480μg/cm2 ii) 可结合不同大小的DNA(6n.t.)，RNA和蛋白质。 iii) 韧性好 iv) 可用于电转移 v) 可进行反复多次杂交试验 vi) 广泛的化学耐受性和可高温消毒 *不能用于蛋白质的直接染色。 ii. 尼龙66 广泛用于核酸印迹分析，静电荷可从pH4时阳离子状态转变 为pH7时阴离子状态，电转移时要注意。 4）离子膜 i. DEAE-纤维素纸(可用于ss-DNA, ds-DNA, RNA的制备回收) ii. CM-纤维素纸(可用于碱性蛋白质的结合)
2.固定基质的选择依据 1)强度,耐久性,操作简便 2)高信噪比(低本底高信号) 3)生物大分子的结合容量和稳定性 4)重现性好 3.各种杂交样品膜的制备 1)原位杂交样品膜的制备 i.原位菌落杂交样品膜 布基因组 文库或cDNA 文库克隆 扩增质粒 0.5-1mm (不必要 影印 37℃至 LB+AP NCF 37℃ 过夜 Ap\培养B+AP Cm NCF 涂菌 保存平板待用
2. 固定基质的选择依据 1）强度，耐久性，操作简便 2）高信噪比（低本底高信号） 3）生物大分子的结合容量和稳定性 4）重现性好 3. 各种杂交样品膜的制备 1）原位杂交样品膜的制备 i. 原位菌落杂交样品膜 涂布基因组 文库或cDNA 文库克隆 LB+AP 37℃ 过夜 0.5-1mm 影印 NCF LB+AP 37℃至 0.5-1mm Apr Cmr 扩增质粒 (不必要） NCF 涂菌 Apr 培养 保存平板待用
III 80℃真 空干燥 10% SDS 0. 5N NaoH IM Tris pH7. 4 1. 5M NaCl+ 0. 5M Tris pH7. 4 细胞培养(高密度,几百一十万个菌落或低密度,几百 个以下) i)细菌细胞原位裂解与DNA变性 i.原位噬菌斑杂交样品膜 i)细胞感染和噬菌斑形成(10,00020,00平板) i)噬菌体转移—用NCF作影印 iDNA变性与固定(与上同)
i) 细胞培养（高密度，几百—十万个菌落或低密度，几百 个以下） ii) 细菌细胞原位裂解与DNA变性 ii. 原位噬菌斑杂交样品膜 i) 细胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板） ii) 噬菌体转移—用NCF作影印 iii) DNA变性与固定（与上同） I II III IV 5' 5' 5' 10% SDS 0.5N NaOH 1M Tris pH7.4 1.5M NaCl+ 0.5M Tris pH7.4 80℃真 空干燥
2)斑点杂交样品膜的制备 制备样品→点样→固定(可用斑点杂交仪或直接点样) NCF 点样板 96孔 滤纸 支撑板 12×8 至真空泵 废液储槽 3)转移杂交样品膜的制备 i.扩散法( Difusion blotting method) 3M滤纸 NCF 用于转移蛋白质, 凝胶 全部装置浸在缓 冲液中1.5-2天 3M滤纸
2） 斑点杂交样品膜的制备 制备样品→点样→固定（可用斑点杂交仪或直接点样） NCF 滤纸 点样板 支撑板 至真空泵 废液储槽 96孔 12×8 3）转移杂交样品膜的制备 i. 扩散法（Difusion blotting method ) 3MM滤纸 NCF 凝胶 NCF 3MM滤纸 用于转移蛋白质， 全部装置浸在缓 冲液中1.5-2天