第二章 细胞生物学实验枝术 6脆Be METHODS AND TECHNIQUES
第一节显微技术 显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。 前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。 一、光学显微镜 (一)、普通光学显微镜 普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器：②光学放大系 统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜 组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便（图2-1）。 图2-1尼康E-600显微镜
第一节 显微技术 显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。 前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。 —、光学显微镜 （一）、普通光学显微镜 普通生物显微镜由 3 部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系 统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜 组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便（图 2-1）。 图 2-1 尼康 E-600 显微镜
显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力(resolution)有关，分 辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决 定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为： R=0.61A/N.A.N.A.n sina/2 式中：n=介质折射率；a=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率(numeric aperture)。镜口角总是要小于180`，所以sina/2的最大值必然小于1。 表2-1及中介质的折射率 介质 空气 水 香柏油 a溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对 于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可 接近1.5。 普通光线的波长为400~700nm,因此显微镜分辨力数值不会小于0.2ym,人眼的分辨力 是0.2mm,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X
显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关，分 辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标 25cm 处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决 定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为： R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2 式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于 180˚，所以 sina/2 的最大值必然小于 1。 表 2-1 及中介质的折射率 介质 空气 水 香柏油 α 溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66 制作光学镜头所用的玻璃折射率为 1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对 于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为 0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可 接近 1.5。 普通光线的波长为 400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于 0.2μm，人眼的分辨力 是 0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为 1000X
(二)、荧光显微镜 图2-2尼康E800荧光DI1C显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发 荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜（图2 2,3,4)就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一
（二）、荧光显微镜 图 2-2 尼康 E800 荧光 DIC 显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发 荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜（图 2- 2，3，4）就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一
3 second barrier filter:cuts out unwanted fluorescent signals, passing the specific green fluorescein emission between 520 and 560 nm LIGHT SOURCE 2 beam-splitting mirror:reflects light below 510 nm but transmits light above 510 nm 1 first barrier filter:lets through only blue light with a wavelength between 450 and 490 nm objective lens object 图2-3落射式照明原理 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（图2-3）： 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线， 用以保护人目
图 2-3 落射式照明原理 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别： 1. 照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（图 2-3）； 2. 光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 3. 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线， 用以保护人目