林木遗传育种实验实习指导二〇一六年三月
林木遗传育种实验实习指导 二〇一六年三月
目录第一部分林木遗传育种实验指导实验一植物根尖细胞有丝分裂染色体制片与观察2实验二植物花粉母细胞减数分裂染色体制片与观察.4实验三植物染色体核型分析，.8实验四植物多倍体诱导及鉴定..12实验五玉米一对性状的遗传分析，..16实验六玉米两对性状的遗传分析.18实验七连锁遗传规律的验证..20.22实验八利用CTAB法提取植物DNA实验九紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度.25实验十聚合酶链式反应...27实验十二琼脂糖凝胶电泳..30.33实验十二植物总RNA的提取实验十三MS培养基的配制与灭菌.....35实验十四植物愈伤组织诱导..39实验十五花粉贮藏及花粉生活力的测定.41...45实验十六树木有性杂交第二部分林木遗传育种实习指导..49...50实习一油松种子园调查与参观.53实习二优良资源圃调查与参观...5实习三油松人工林优树选择附录.58附录1显微镜日常维护及保养.....58..60附录2常用染液配制方法附录3植物组织培养常用培养基的成分..64附录4×2值表..65主要参考文献.66
目 录 第一部分 林木遗传育种实验指导.1 实验一 植物根尖细胞有丝分裂染色体制片与观察.2 实验二 植物花粉母细胞减数分裂染色体制片与观察.4 实验三 植物染色体核型分析.8 实验四 植物多倍体诱导及鉴定.12 实验五 玉米一对性状的遗传分析.16 实验六 玉米两对性状的遗传分析.18 实验七 连锁遗传规律的 2 验证 .20 实验八 利用 CTAB 法提取植物 DNA .22 实验九 紫外分光光度法测定 DNA 浓度和纯度.25 实验十 聚合酶链式反应.27 实验十一 琼脂糖凝胶电泳.30 实验十二 植物总 RNA 的提取.33 实验十三 MS 培养基的配制与灭菌.35 实验十四 植物愈伤组织诱导.39 实验十五 花粉贮藏及花粉生活力的测定.41 实验十六 树木有性杂交.45 第二部分 林木遗传育种实习指导.49 实习一 油松种子园调查与参观.50 实习二 优良资源圃调查与参观.53 实习三 油松人工林优树选择.55 附录 .58 附录 1 显微镜日常维护及保养.58 附录 2 常用染液配制方法.60 附录 3 植物组织培养常用培养基的成分.64 附录 4 2 值表 .65 主要参考文献 .66
第一部分林木遗传育种实验指导1、实验目的遗传学与育种学实验是林木遗传学、林木育种学和园林植物遗传育种学等专业课程的重要组成部分。实验课的目的在于加深学生对课堂理论教学的理解和认识，掌握实验操作方法，培养学生自己动手解决具体问题和从事科研实验的能力。2、实验地点内蒙古农业大学林木遗传育种实验室3、实验室工作规程(1）实验前必须预习实验指导书，明确本次实验的目的、原理、内容和方法。实验室必须保持安静，按实验指导书和指导教师的规定进行操作，并记录实验中出现的情况和实验结果，整理分析，得出结论，按实验作业要求写出实验报告。(2）正确使用显微镜及各种仪器，切勿使染料或试剂沾污镜头、镜台及所用仪器，如有沾污须随时用擦镜纸擦干净。注意不要把酸、碱等试剂洒落在工作台上，以防腐蚀。使用腐蚀性和有毒药品时，谨防溅入眼、鼻和触及皮肤。(3）取液体药品时，所用各类量具必须分开，不可混用，用后必须马上冲洗干净。称取固体药品时，先在天平上铺垫称量纸，保护秤具，勿受药品的腐蚀和防止药品相混。(4）用过的酸类、碱类、染料等应倒入废液缸内，不可直接倒入水槽中。废酒精、二甲苯等应分别倒入指定的容器中，以便回收利用。（5）实验完毕须做好清洁整理工作，所用的仪器、物品应放还原处。在实验过程中如有损坏或丢失仪器用具，按情况予以登记或赔偿处理。(6）全班实验结束后，值日生应对实验室进行全面清理打扫。离开实验室前须切断仪器电源，关紧水龙头和门窗。1
1 第一部分 林木遗传育种实验指导 1、实验目的 遗传学与育种学实验是林木遗传学、林木育种学和园林植物遗传育种学等专 业课程的重要组成部分。实验课的目的在于加深学生对课堂理论教学的理解和认 识，掌握实验操作方法，培养学生自己动手解决具体问题和从事科研实验的能力。 2、实验地点 内蒙古农业大学林木遗传育种实验室 3、实验室工作规程 (1) 实验前必须预习实验指导书，明确本次实验的目的、原理、内容和方法。 实验室必须保持安静，按实验指导书和指导教师的规定进行操作，并记录实验中 出现的情况和实验结果，整理分析，得出结论，按实验作业要求写出实验报告。 (2) 正确使用显微镜及各种仪器，切勿使染料或试剂沾污镜头、镜台及所用 仪器，如有沾污须随时用擦镜纸擦干净。注意不要把酸、碱等试剂洒落在工作台 上，以防腐蚀。使用腐蚀性和有毒药品时，谨防溅入眼、鼻和触及皮肤。 (3) 取液体药品时，所用各类量具必须分开，不可混用，用后必须马上冲洗 干净。称取固体药品时，先在天平上铺垫称量纸，保护秤具，勿受药品的腐蚀和 防止药品相混。 (4) 用过的酸类、碱类、染料等应倒入废液缸内，不可直接倒入水槽中。废 酒精、二甲苯等应分别倒入指定的容器中，以便回收利用。 (5) 实验完毕须做好清洁整理工作，所用的仪器、物品应放还原处。在实验 过程中如有损坏或丢失仪器用具，按情况予以登记或赔偿处理。 (6) 全班实验结束后，值日生应对实验室进行全面清理打扫。离开实验室前 须切断仪器电源，关紧水龙头和门窗
实验一植物根尖细胞有丝分裂染色体制片与观察压片法由Belling在1921年首创，是最常用的有丝分裂制片方法。经过不断的改进，技术日臻完善。不同研究者所用的压片方法虽不尽相同，但大体上都包括取材、预处理、固定、解离、染色和压片几个步骤。预处理的目的是获得较多的中期分裂相，同时可以使染色体收缩变短，这样就使染色体在压片时容易分散。预处理的药品可以使用秋水仙素（0.01%~0.2%）、对二氯苯（饱和溶液）、8-羟基喹啉（0.002~0.004mol/L）、α-溴萘（饱和溶液）等。为了能够在显微镜下观察到清晰的染色体，还需要对染色体标本进行染色，较好的染色方法有Feulgen染色法、铁帆-苏木精染色法、醋酸洋红染色法、卡宝品红染色法等。在遗传育种实践中，有丝分裂制片主要用于：染色体计数、建立一个物种的核型、研究染色体缺失和重复等变异。一、实验目的学习植物组织和细胞的固定、解离及压片方法，观察和识别根尖细胞的有丝分裂过程和染色体的动态变化。二、实验原理植物根尖与茎尖是有丝分裂的高发部位。该部分细胞依一定程序有规律的进行着有丝分裂过程。对根尖、茎尖等材料进行处理和制片后，可以在显微镜下观察到有丝分裂的各个时期和染色体形态变化，进一步了解染色体的动态行为。三、实验材料、器材和试剂1、材料：洋葱鳞茎、大蒜、蚕豆、玉米、小麦种子等2、器材：显微镜、解剖针、刀片、镊子、剪子、滤纸、载玻片、盖玻片、量筒、烧杯、滴瓶等3、试剂：无水乙醇、冰醋酸、1mol/L盐酸、醋酸洋红染液等卡诺固定液：3份无水乙醇，加入1份冰醋酸（现配现用）2
2 实验一 植物根尖细胞有丝分裂染色体制片与观察 压片法由 Belling 在 1921 年首创，是最常用的有丝分裂制片方法。经过不断 的改进，技术日臻完善。不同研究者所用的压片方法虽不尽相同，但大体上都包 括取材、预处理、固定、解离、染色和压片几个步骤。预处理的目的是获得较多 的中期分裂相，同时可以使染色体收缩变短，这样就使染色体在压片时容易分散。 预处理的药品可以使用秋水仙素（0.01%~0.2%）、对二氯苯（饱和溶液）、8-羟基 喹啉（0.002~0.004 mol/L）、α -溴萘（饱和溶液）等。为了能够在显微镜下观察 到清晰的染色体，还需要对染色体标本进行染色，较好的染色方法有 Feulgen 染 色法、铁帆-苏木精染色法、醋酸洋红染色法、卡宝品红染色法等。 在遗传育种实践中，有丝分裂制片主要用于：染色体计数、建立一个物种的 核型、研究染色体缺失和重复等变异。 一、实验目的 学习植物组织和细胞的固定、解离及压片方法，观察和识别根尖细胞的有丝 分裂过程和染色体的动态变化。 二、实验原理 植物根尖与茎尖是有丝分裂的高发部位。该部分细胞依一定程序有规律的进 行着有丝分裂过程。对根尖、茎尖等材料进行处理和制片后，可以在显微镜下观 察到有丝分裂的各个时期和染色体形态变化，进一步了解染色体的动态行为。 三、实验材料、器材和试剂 1、材料：洋葱鳞茎、大蒜、蚕豆、玉米、小麦种子等 2、器材：显微镜、解剖针、刀片、镊子、剪子、滤纸、载玻片、盖玻片、量筒、 烧杯、滴瓶等 3、试剂：无水乙醇、冰醋酸、1 mol/L 盐酸、醋酸洋红染液等 卡诺固定液：3 份无水乙醇，加入 1 份冰醋酸（现配现用）
四、实验方法和步骤（以洋葱为例）1、材料培养剪去洋葱的老根，用刀削去鳞茎根部干死的部分，剥除鳞茎于枯的表皮，然后置于盛有清水的烧杯上，让清水没过其根部。在水培过程中要注意及时换水。培养至根长1~2cm时取材固定，取材时间一般在上午8~10时。2、固定将选好的根尖放入卡诺固定液中（固定液的量约为材料的10倍，要求一个容器中所装的材料不能过多，温度不能过高）。固定2h后用95%乙醇冲洗，再转入70%乙醇中，于4℃冰箱内保存，保存时间最好不要超过2个月，如需要长期保存，可以定期更换乙醇溶液。3、解离用1mol/L盐酸将材料在室温下浸泡10~20min，除去未被固定的蛋白质，并使细胞间层的果胶类物质解体、细胞壁软化。4、染色及压片取解离好的根尖置于载玻片上，将伸长区以上的部位切去，保留分生组织（经酸解离后，根尖的顶端有一段乳白色的组织即为分生组织），用刀片将其切成小块。加一滴醋酸洋红染液，染色2~5min，盖上盖玻片，包被吸水纸吸干多余染色液，用拇指稍用力压片，再用带橡皮头的铅笔垂直轻敲，敲时应注意不要使盖玻片移动，将细胞完全压平在同一平面上。5、镜检首先用显微镜的低倍镜找出理想的视野及典型的分裂细胞，再用高倍镜进行观察，描述和计数染色体的动态和数目。五、实验作业和思考题1、绘制有丝分裂中期的细胞及染色体的生物图。2、请总结哪些因素会影响制片的效果。3、在显微镜下观察时，细胞分裂周期中哪一个时期的细胞所占的比例最大，为什么？n
3 四、实验方法和步骤（以洋葱为例） 1、材料培养 剪去洋葱的老根，用刀削去鳞茎根部干死的部分，剥除鳞茎干枯的表皮，然 后置于盛有清水的烧杯上，让清水没过其根部。在水培过程中要注意及时换水。 培养至根长 1~2 cm 时取材固定，取材时间一般在上午 8~10 时。 2、固定 将选好的根尖放入卡诺固定液中（固定液的量约为材料的 10 倍，要求一个 容器中所装的材料不能过多，温度不能过高）。固定 2h 后用 95%乙醇冲洗，再转 入 70%乙醇中，于 4℃冰箱内保存，保存时间最好不要超过 2 个月，如需要长期 保存，可以定期更换乙醇溶液。 3、解离 用 1 mol/L 盐酸将材料在室温下浸泡 10~20 min，除去未被固定的蛋白质， 并使细胞间层的果胶类物质解体、细胞壁软化。 4、染色及压片 取解离好的根尖置于载玻片上，将伸长区以上的部位切去，保留分生组织（经 酸解离后，根尖的顶端有一段乳白色的组织即为分生组织），用刀片将其切成小 块。加一滴醋酸洋红染液，染色 2~5 min，盖上盖玻片，包被吸水纸吸干多余染 色液，用拇指稍用力压片，再用带橡皮头的铅笔垂直轻敲，敲时应注意不要使盖 玻片移动，将细胞完全压平在同一平面上。 5、镜检 首先用显微镜的低倍镜找出理想的视野及典型的分裂细胞，再用高倍镜进行 观察，描述和计数染色体的动态和数目。 五、实验作业和思考题 1、绘制有丝分裂中期的细胞及染色体的生物图。 2、请总结哪些因素会影响制片的效果。 3、在显微镜下观察时，细胞分裂周期中哪一个时期的细胞所占的比例最大，为 什么？