、限制性核酸内切酶 定义 2.功能 、限制性核酸内切酶的类型及作用机制 限制性核酸内切酶的类型 2.限制性核酸内切酶的作用机制 限制性核酸内切酶命名规则及识别序列 1.限制性核酸内切酶的命名规则 2.限制性核酸内切酶的识别序列 四、限制性核酸内切酶切割DNA的位点 五、限制性核酸内切酶反应系统 第四节特异性DNMA片段的PR扩增 PCR基本原理 1.PCR扩增的定义 2.PCR扩增的基本原理 PCR扩增特异性DNA片段的主要条件 1.模板核酸 2.引物 3.缓冲液 5.三磷酸脱氧核苷酸(dNIP) 6.耐热DNA聚合酶 7.温度循环参数 1)变性温度与时间 2)复性温度与时间 3)延伸温度与时间 4)循环数 、PCR扩增DNA片段的方法 1.试剂 1)引物 2)耐热的DNA聚合酶 3)10×PCR缓冲液 4)5mmol/ L dNTP贮备液 5)DNA模板 2.基本反应步骤 PCR由变性一退火-延伸三个基本反应步骤构成 )模板DNA的变性 2)模板DNA与引物的退火(复性) 3)引物的延伸 四、常用的DNA片段PCR扩增系统 1.兼并引物( Degenerate Primer)PCR 2.套式引物( Nested Primer)PCR 3.复合PCR( Multiplex PCR) 4.反向PCR( Inverse PCR或 Reverse pcr)
一、限制性核酸内切酶 1． 定义 2． 功能 二、限制性核酸内切酶的类型及作用机制 1． 限制性核酸内切酶的类型 2．限制性核酸内切酶的作用机制 三、限制性核酸内切酶命名规则及识别序列 1． 限制性核酸内切酶的命名规则 2．限制性核酸内切酶的识别序列 四、限制性核酸内切酶切割 DNA 的位点 五、限制性核酸内切酶反应系统 第四节 特异性 DNA 片段的 PCR 扩增 一、PCR 基本原理 1． PCR 扩增的定义 2． PCR 扩增的基本原理 二、PCR 扩增特异性 DNA 片段的主要条件 1．模板核酸 2．引物 3．缓冲液 4．Mg2+ 5．三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） 6．耐热 DNA 聚合酶 7．温度循环参数 1）变性温度与时间 2）复性温度与时间 3）延伸温度与时间 4）循环数 三、PCR 扩增 DNA 片段的方法 1．试剂 1）引物 2）耐热的 DNA 聚合酶 3）10×PCR 缓冲液 4）5mmol/L dNTP 贮备液 5）DNA 模板 2．基本反应步骤 PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成 1）模板 DNA 的变性 2）模板 DNA 与引物的退火(复性) 3）引物的延伸 四、常用的 DNA 片段 PCR 扩增系统 1．兼并引物（Degenerate Primer）PCR 2．套式引物（Nested Primer）PCR 3．复合 PCR（Multiplex PCR） 4．反向 PCR（Inverse PCR 或 Reverse PCR）
5.不对称PCR( Asymmetric PCR) 6.标记PCR( LP-PCR)和彩色PCR 7.加端PCR 8.锚定PCR或固定PCR 第五节DNA片段的化学合成 、苷酸片段的化学合成方法 1.原位合成 2.直接点样 化学方法合成的DNA片段 历史 2.基本原理 3.基本原料 4.合成步骤 第六节DNA片段大小的凝胶电泳检测 实验室中常用的电泳参数 1.琼脂糖凝胶电泳参数 2.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数 3.脉冲场凝胶电泳参数 、DNA片段的连接及重组类型 DNA重组的概念及作用 2.DNA片段的连接重组 3.DNA连接酶 4.DNA片段之间的连接 5.DNA重组类型
5．不对称 PCR（Asymmetric PCR） 6．标记 PCR（LP-PCR）和彩色 PCR 7．加端 PCR 8．锚定 PCR 或固定 PCR 第五节 DNA 片段的化学合成 一、苷酸片段的化学合成方法 1．原位合成 2．直接点样 二、化学方法合成的 DNA 片段 1．历史 2．基本原理 3．基本原料 4．合成步骤 第六节 DNA 片段大小的凝胶电泳检测 一、实验室中常用的电泳参数 1. 琼脂糖凝胶电泳参数 2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数 3. 脉冲场凝胶电泳参数 二、DNA 片段的连接及重组类型 1．DNA 重组的概念及作用 2．DNA 片段的连接重组 3．DNA 连接酶 4．DNA 片段之间的连接 5．DNA 重组类型
名称 第三章基因克隆的载体 使学生了解与构建克隆载体相关的质粒和λ噬菌体的性质:启动子 目的探针型克隆载体和诱导型表达克隆载体等特殊用途的克隆载体。掌握大肠 要求杆菌质粒克隆载体pBR2的构建熟练掌握构建噬菌体克隆载体的基 本策略,并了解其应用 重点 大肠杆菌质粒克隆载体pBR322的构建。构建λ噬菌体克隆载体的基 本策略及其应用。 难点 教学组织 教学方法 引言 6学时 分子克隆的载体 载体的定义 2.作为载体应该具备的基本条件 第一节质粒克隆载体 质粒定义与构型 定义 2.构型 质粒克隆载体的特性 1.具有独立复制起点 2.具有较小的相对分子质量 3.具有较高拷贝数 采用引导 4.具有选择性标记 式的教学 5.易于导入细胞 讲授法 6.具有安全性 并辅助多 构建质粒克隆载体时预处理的主要问题、基本策略和具|媒体课件 体实例 1.构建一种质粒载体时预处理的主要问题 2.质粒克隆载体构建的基本策略 3.以常用的pBR322为例说明载体构建的步骤 1)pBR322的定义 质粒载体的特点 质粒载体构建的步骤 质粒载体的优点 第二节病毒(噬菌体)克隆载体 、λ噬菌体克隆载体 1.关于入噬菌体的简介 2.λ噬菌体的构建 cosmid克隆载体 1. cosmid克隆载体的特征 2. cosmid克隆载体的构建 三、M13噬菌体克隆载体 1. M13 DNA
名 称 第三章 基因克隆的载体 目 的 要 求 使学生了解与构建克隆载体相关的质粒和 λ 噬菌体的性质；启动子 探针型克隆载体和诱导型表达克隆载体等特殊用途的克隆载体。掌握大肠 杆菌质粒克隆载体 pBR322 的构建。熟练掌握构建 λ 噬菌体克隆载体的基 本策略，并了解其应用。 重 点 难 点 大肠杆菌质粒克隆载体 pBR322 的构建。构建 λ 噬菌体克隆载体的基 本策略及其应用。 时 间 教学组织 教学方法 6 学时 引 言 一、分子克隆的载体 1．载体的定义 2．作为载体应该具备的基本条件 第一节 质粒克隆载体 一、质粒定义与构型 1．定义 2．构型 二、质粒克隆载体的特性 1． 具有独立复制起点 2．具有较小的相对分子质量 3．具有较高拷贝数 4．具有选择性标记 5．易于导入细胞 6．具有安全性 三、构建质粒克隆载体时预处理的主要问题、基本策略和具 体实例 1．构建一种质粒载体时预处理的主要问题 2．质粒克隆载体构建的基本策略 3．以常用的 pBR322 为例说明载体构建的步骤 1）pBR322 的定义 2) pBR322 质粒载体的特点 3）pBR322 质粒载体构建的步骤 4）pBR322 质粒载体的优点 第二节 病毒（噬菌体）克隆载体 一、λ 噬菌体克隆载体 1．关于 λ 噬菌体的简介 2．λ 噬菌体的构建 二、cosmid 克隆载体 1．cosmid 克隆载体的特征 2．cosmid 克隆载体的构建 三、M13 噬菌体克隆载体 1．M13 DNA 采用引导 式的教学 讲授法， 并辅助多 媒体课件
3DNA的复制和M13噬菌体的增殖 3.构建M13噬茵体克隆载体的策略和途径 4.M13克隆载体的应用 四、SV40克隆载体 1.SV40-DNA的复制和SV40的增殖 2.构建SV40克隆载体的基本策略和途径 1)取代型克隆载体 2)病毒一质粒重组克隆载体 五、反转录病毒克隆载体 1.定义 2.劳斯肉瘤病毒的生物学特性 3.构建RSV反转录病毒克隆载体的策略和途径 第三节染色体定位整合克隆载体 一、定位整合克隆载体的几种模式 1.内源平台双交换置换克隆载体 2.外源平台双交换置换克隆载体 3.内源平台双交换插入克隆载体 4.内源平台单交换插入克隆载体 、定位整合克隆载体 植物染色体定位整合克隆载体 2.动物染色体定位整合克隆载休 第四节人工染色体克隆载体 一、人工染色体克隆载体的含义和特点 1.含义 2.特点 、人工染色体克隆载体的构建 三、人工染色体克隆载体的应用 1.构建基因组文库 2.基因治疗 3.基因功能的鉴定 第五节特殊用途克隆载体 、启动子探针型克隆载体 1.启动子探针型克隆载体的定义 2.类型和相应内含简介 1)Kanr标记的启动子探针克隆载体。 2)gfp标记的启动子探针克隆载体。 3)hPh标记的启动于探针克隆载体。 4)Kanr标记的自动子探针克隆载体 诱导型表达克隆载体 1.诱导型表达克隆载体的定义 2.类型和相应内含简介 1)二价金属离子诱导表达克隆载体。 2)干旱诱导表达克隆载体 3)红光诱导表达克降载体
2．M13 DNA 的复制和 M13 噬菌体的增殖 3．构建 M13 噬茵体克隆载体的策略和途径 4．M13 克隆载体的应用 四、SV40 克隆载体 1．SV40－DNA 的复制和 SV40 的增殖 2．构建 SV40 克隆载体的基本策略和途径 1）取代型克隆载体 2）病毒－质粒重组克隆载体。 五、反转录病毒克隆载体 1．定义 2．劳斯肉瘤病毒的生物学特性 3．构建 RSV 反转录病毒克隆载体的策略和途径 第三节 染色体定位整合克隆载体 一、定位整合克隆载体的几种模式 1．内源平台双交换置换克隆载体 2．外源平台双交换置换克隆载体 3．内源平台双交换插入克隆载体 4．内源平台单交换插入克隆载体 二、定位整合克隆载体 1．植物染色体定位整合克隆载体 2．动物染色体定位整合克隆载休 第四节 人工染色体克隆载体 一、人工染色体克隆载体的含义和特点 1． 含义 2． 特点 二、人工染色体克隆载体的构建 三、人工染色体克隆载体的应用 1．构建基因组文库 2．基因治疗 3．基因功能的鉴定 第五节 特殊用途克隆载体 一、启动子探针型克隆载体 1．启动子探针型克隆载体的定义 2．类型和相应内含简介 1）Kanr 标记的启动子探针克隆载体。 2）gfp 标记的启动子探针克隆载体。 3）hPh 标记的启动于探针克隆载体。 4）Kanr 标记的自动子探针克隆载体。 二、诱导型表达克隆载体 1．诱导型表达克隆载体的定义 2．类型和相应内含简介 1）二价金属离子诱导表达克隆载体。 2）干旱诱导表达克隆载体。 3）红光诱导表达克降载体
、反义表达克隆载体 反义表达克隆载体 2.类型及相应内含简介 1)SOD基因反义表达更隆载体 2)NHEI基因反义表达克隆载体
三、反义表达克隆载体 1．反义表达克隆载体 2．类型及相应内含简介 1）SOD 基因反义表达更隆载体． 2）NHE1 基因反义表达克隆载体