上海中医药大学《实验中医学》教案(7) 课程名称实验中医学(理论部分)总学时数36 专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤 内容实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研时|16 究中的应用 本次1.掌握不同学科实验研究方法的特点和优势 课目2.掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法(包括一种或几种方 的要法) 求|3.了解各学科的主要实验研究方法。 了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用, 5.了解了解各学科研究中医药学的现状。 本次第一节解剖学方法及其在中医研究中的应用 课的1.大体解剖学的主要方法 重点2.大体解剖学方法研究中医的现状。 难点第二节组织学方法及其在中医研究中的应用 1.组织学的主要研究方法。 2.组织学方法研究中医的现状 第三节电镜技术及其在中医研究中的应用 1.电子显微镜及电子显微术概况。 2.电子显微术研究中医的现状。 第四节生物化学方法及其在中医研究中的应用 1.生物化学的主要方法 2.生物化学方法研究中医的现状。 第五节生理学方法及其在中医研究中的应用 1.生理学的主要方法 生理学方法研究中医的现状 第六节免疫学方法及其在中医研究中的应用 1.免疫学的主要方法。 2.用免疫学方法研究中医的现状。 第七节核医学方法及其在中医研究中的应用 1.核医学的主要研究方法。 2.用核医学方法研究中医的现状。 第八节分子生物学方法及其在中医研究中的应用 1.分子生物学的主要技术和方法 2.用分子生物学方法研究中医的现状 次 的多媒体设备
上海中医药大学《实验中医学》教案（7） 课程名称 实验中医学（理论部分） 总学时数 36 专业 中医基础和中医临床专业 授课教师 方肇勤 内容 实验中医学常用的实验研究方法及其在中医研 究中的应用 时 数 16 本 次 课 目 的 要 求 1．掌握不同学科实验研究方法的特点和优势。 2．掌握如何根据实验研究的要求选择实验研究方法（包括一种或几种方 法）。 3．了解各学科的主要实验研究方法。 4．了解各学科实验研究方法在中医药研究中的应用。 5．了解了解各学科研究中医药学的现状。 本 次 课 的 重 点 难点 第一节 解剖学方法及其在中医研究中的应用 1．大体解剖学的主要方法。 2．大体解剖学方法研究中医的现状。 第二节 组织学方法及其在中医研究中的应用 1．组织学的主要研究方法。 2．组织学方法研究中医的现状。 第三节 电镜技术及其在中医研究中的应用 1．电子显微镜及电子显微术概况。 2．电子显微术研究中医的现状。 第四节 生物化学方法及其在中医研究中的应用 1．生物化学的主要方法。 2．生物化学方法研究中医的现状。 第五节 生理学方法及其在中医研究中的应用 1．生理学的主要方法。 2．生理学方法研究中医的现状。 第六节 免疫学方法及其在中医研究中的应用 1．免疫学的主要方法。 2．用免疫学方法研究中医的现状。 第七节 核医学方法及其在中医研究中的应用 1．核医学的主要研究方法。 2．用核医学方法研究中医的现状。 第八节 分子生物学方法及其在中医研究中的应用 1．分子生物学的主要技术和方法。 2．用分子生物学方法研究中医的现状。 本 次 课 的 应 用 教具 多媒体设备
第六节免疫学方法及其 在中医研究中的应用 (2学时) 第一段简要介绍了中医学有关免疫学的发展历史和贡献 第二段简要介绍了免疫学的定义、分化和与中医药继承和发展的关系 第一句化有定义的意义:“现代免疫的概念认为免疫是识别和排除抗原性异物的过 程,以维持机体的生理性平衡,在多数情况下对机体具有保护作用,如其功能发生异常,则 也可发生疾病。” 第三段进一步解释免疫的功能、功能紊乱的表现和与中医药的关系: 人体免疫功能主要有三种:免疫防御功能、自身稳定功能和免疫监视功能。” 1)免疫防御功能是指机体抵抗各种病原微生物并免除毒素的毒害作用,以及抵抗各 种异体抗原物质的侵袭能力,包括非特异性免疫和特异性免疫 2)自身稳定功能指机体清除自身衰老及伤亡的细胞,以利于组织细胞更新、维持内 环境平衡与稳定,亦即清除内源性抗原(类似内邪),以保生理功能的稳定性。 3)免疫监视功能是指在正常情况下,人体的T细胞能识别并杀伤体内经常出现的少 量异常细胞,包括癌细胞 第四段,阐述了章教授的观点: “正气能驱除外邪、内邪,维持人体健康,所以,免疫功能与其相似。正气是由肾脏 的先天精气、脾运化的水谷之气和肺吸入的清气构成,所以中医的肾、脾、肺三脏与免疫功 能关系也较大。”“正气与肺、脾、肾关系密切,肺、脾、肾的强弱决定正气盛衰。根据中医 理论,肾是根本,脾是化源,肺起敷布和辅助作用,就机体免疫功能而言,肾虚免疫功能损 害最重,脾虚次之,肺虚又次之,若慢性病久病失治,由轻而重,也多肺→脾→肾的规律发 展,从而说明了中医脏象学说与现代免疫学的联系。” 第五段讲“用免疫学方法研究中医的目的及意义”。 1)探讨有关中医理论。虚证一一免疫功能一般低下,且以细胞免疫功能较为明显 实证一一免疫功能有亢进趋势,具有较大理论和实际意义。 2)阐明中医治疗机理。一些中药能调节免疫功能:扶正固本药促进免疫功能:祛邪 药抑制免疫、防治过敏反应。今后的任务是进一步阐明其作用原理,提高疗效,并弄清其适 应症(这个观点十分重要,确实是中医药研究的方向之一) 3)发掘开发中药。发展促进免疫或抑制免疫中药,开发产品 4)中西医结合,发展中医学及免疫学。(介绍了两个观点:)(1)可将中医与免疫作 为中西结合的突破口。(2)弄清正气、内邪、外邪、虚证、实证与人体免疫功能、免疫系统、 抗原、免疫分子等免疫理论和实际的关系,将大大有利于中医学与免疫学的发展。 6.6.1免疫学的主要方法 介绍了几个定义 免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测 (1)体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合,并在一些辅助 因子参与下出现反应,从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。此外,尚包括检测体 液中的各种可溶性免疫分子,如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等 (2)细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞(T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨 噬细胞等)表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等,测定各种免疫细胞及其亚群的数量 和功能,以帮助了解机体的细胞免疫水平 进而介绍了其延伸的内容“免疫学检测方法的应用范围越来越广泛,包括传染病、免 疫性疾病(免疫缺陷、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥反应)、肿瘤等领域,也可用 于微量蛋白、微量分泌激素、微量药物中抗原等的测定。中医中药的疗效及机理、某些中医
第六节 免疫学方法及其 在中医研究中的应用 （2 学时） 第一段简要介绍了中医学有关免疫学的发展历史和贡献。 第二段简要介绍了免疫学的定义、分化和与中医药继承和发展的关系。 第一句化有定义的意义：“现代免疫的概念认为免疫是识别和排除抗原性异物的过 程，以维持机体的生理性平衡，在多数情况下对机体具有保护作用，如其功能发生异常，则 也可发生疾病。” 第三段进一步解释免疫的功能、功能紊乱的表现和与中医药的关系： “人体免疫功能主要有三种：免疫防御功能、自身稳定功能和免疫监视功能。” 1）免疫防御功能是指机体抵抗各种病原微生物并免除毒素的毒害作用，以及抵抗各 种异体抗原物质的侵袭能力，包括非特异性免疫和特异性免疫。 2）自身稳定功能指机体清除自身衰老及伤亡的细胞，以利于组织细胞更新、维持内 环境平衡与稳定，亦即清除内源性抗原（类似内邪），以保生理功能的稳定性。 3）免疫监视功能是指在正常情况下，人体的 T 细胞能识别并杀伤体内经常出现的少 量异常细胞，包括癌细胞。 第四段，阐述了章教授的观点： “正气能驱除外邪、内邪，维持人体健康，所以，免疫功能与其相似。正气是由肾脏 的先天精气、脾运化的水谷之气和肺吸入的清气构成，所以中医的肾、脾、肺三脏与免疫功 能关系也较大。”“正气与肺、脾、肾关系密切，肺、脾、肾的强弱决定正气盛衰。根据中医 理论，肾是根本，脾是化源，肺起敷布和辅助作用，就机体免疫功能而言，肾虚免疫功能损 害最重，脾虚次之，肺虚又次之，若慢性病久病失治，由轻而重，也多肺→脾→肾的规律发 展，从而说明了中医脏象学说与现代免疫学的联系。” 第五段讲“用免疫学方法研究中医的目的及意义”。 1） 探讨有关中医理论。虚证——免疫功能一般低下，且以细胞免疫功能较为明显； 实证——免疫功能有亢进趋势，具有较大理论和实际意义。 2） 阐明中医治疗机理。一些中药能调节免疫功能：扶正固本药促进免疫功能；祛邪 药抑制免疫、防治过敏反应。今后的任务是进一步阐明其作用原理，提高疗效，并弄清其适 应症（这个观点十分重要，确实是中医药研究的方向之一）。 3） 发掘开发中药。发展促进免疫或抑制免疫中药，开发产品。 4） 中西医结合，发展中医学及免疫学。（介绍了两个观点：）（1）可将中医与免疫作 为中西结合的突破口。（2）弄清正气、内邪、外邪、虚证、实证与人体免疫功能、免疫系统、 抗原、免疫分子等免疫理论和实际的关系，将大大有利于中医学与免疫学的发展。 6．6．1 免疫学的主要方法 介绍了几个定义： 免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫测定。 （1）体液免疫测定主要利用抗原与相应抗体在体外发生特异性结合，并在一些辅助 因子参与下出现反应，从而用已知抗原或抗体来测知未知抗体或抗原。此外，尚包括检测体 液中的各种可溶性免疫分子，如补体、免疫球蛋白、循环复合物、溶菌酶等。 （2）细胞免疫测定法是根据各种免疫细胞（T 细胞、B 细胞、K 细胞、NK 细胞及巨 噬细胞等）表面所具有的独特标志和产生的细胞因子等，测定各种免疫细胞及其亚群的数量 和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。 进而介绍了其延伸的内容“免疫学检测方法的应用范围越来越广泛，包括传染病、免 疫性疾病（免疫缺陷、自身免疫性疾病、变态反应、移植排斥反应）、肿瘤等领域，也可用 于微量蛋白、微量分泌激素、微量药物中抗原等的测定。中医中药的疗效及机理、某些中医
证型与免疫功能的关系、开发中药时的动物实验皆可以应用免疫学方法进行研究观察 在介绍具体方法的时候,请大家考虑,中医药研究如何应用。 6.6.1.1体液免疫检测法 讲抗原与抗体在体外结合反应的一些基本条件,和为什么叫“血清学反应”,以及其 应用领域 1.凝集反应。颗粒性抗原(细菌或红细胞等)与相应抗体特异性结合,在电解质参与 下形成肉眼可见的凝集物,称之为凝集反应。 凝集反应的原理是:抗原与抗体均带负电荷,又皆为亲水胶体,由于同种电荷的相互 排斥及其分子周围的水化膜而呈稳定的胶体溶液。当抗原与抗体特异性结合时,相应的极性 基团(羟基、氨基等)的相互吸附,破坏了水化膜,使亲水胶体变成了憎水胶体:加上存在 的电解质离子会中和一部分负电荷而使抗原抗体相互凝集,形成肉眼可见的凝集物。 )直接凝集反应。颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象,前者多为细 胞表面的结构成分,如细菌或红细胞的表面结构抗原。 (1)玻片法:多用于抗原的定性检测。将含有已知抗体的诊断血清与待测抗原(细 菌或红细胞)滴于玻片上混合并摇动,数分钟后出现肉眼可见的凝集物即为阳性反应。此 法简便快速,常用于鉴定细菌和血型。 (2)试管法:多用于抗体的定量检测。在试管中用生理盐水将待检血清作系列倍比 稀释,然后加入等量已知抗原,混匀、振荡后置37℃过夜,以观察凝集现象。凡最高稀释 度具有明显凝集现象者为该待测血淸的效价(或称滴度)。凝集效价表示血清中抗体的含量, 可根据有关抗体含量高低来辅助诊断或作流行病的调查,如诊断伤寒或副伤寒的肥达氏反 2)间接凝集反应。将可溶性抗原吸附于载体颗粒(如乳胶颗粒、红细胞等)的表面, 称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合,即可出现凝集现象。这个反应常用于测定细 菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体(如抗核抗体、抗肾 抗体、抗甲状腺抗体等)。 根据凝集反应的原理,还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。 2.沉淀反应。可溶性抗原(外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等)与相 应抗体特异性结合,在电解质参与下,形成沉淀物,称为沉淀反应。沉淀反应的抗原多为多 糖、类脂、蛋白质等 )单向扩散试验。这是一种抗原定量试验,是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩 散的沉淀反应。试验时,将已知抗体与融化的琼脂混匀倾注于平皿或玻片上。琼脂凝固后打 孔,孔内加入待检抗原,置湿盒于室温使其扩散,次日观察结果。由于抗体均匀地分布于琼 脂内,抗原从孔中向四周扩散,抗原抗体复合物在孔周围形成沉淀环。沉淀环的直径与孔中 抗原浓度成正比。如事先用不同浓度的已知标准抗原作单向琼脂扩散,并绘制成抗原浓度与 沉淀环直径的标准曲线,则可根据待检抗原孔的沉淀环直径从标准曲线查明其抗原含量。此 法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量 2〕双向扩散试验。这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。将融 化的琼脂倾注于平皿或玻片上,琼脂凝固后打孔,抗原、抗体分别注入孔内,置湿盒内室温 过夜。如抗原与抗体相对应,两者相互扩散可在抗原、抗体孔间呈现清晰的白色沉淀线 对抗原与抗体只形成一条沉淀线,几对抗原与抗体则形成几条沉淀线。本法常用于 定性试验,如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。 3)对流免疫电泳。对流电泳是一敏感快速的检测方法,即在电场作用下的双向免疫 扩散。在用pH86巴比妥缓冲液配制的琼脂板上挖出成对且平行的小孔,将琼脂板放入电 泳槽内,使琼脂板的两孔沿着电场方向,于负极侧的孔内加入抗原,于正极侧的孔内加入抗 体,通电后,抗原带负电荷向正极泳动,抗体分子虽也带负电荷,但受琼脂中电渗作用向负 极移动,抗原和抗体能较快集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的白色沉淀线。只需1 小时左右即可观察结果。此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等 3.中和试验。特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性,抗体使相应抗原的毒性或传 染性消失的反应为中和试验。例如抗毒素中和外毒素的毒性,病毒的中和抗体可使病毒失去 感染性等。诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。乙型溶血性链球
证型与免疫功能的关系、开发中药时的动物实验皆可以应用免疫学方法进行研究观察。” 在介绍具体方法的时候，请大家考虑，中医药研究如何应用。 6．6．1．1 体液免疫检测法 讲抗原与抗体在体外结合反应的一些基本条件，和为什么叫“血清学反应”，以及其 应用领域。 1. 凝集反应。颗粒性抗原（细菌或红细胞等）与相应抗体特异性结合，在电解质参与 下形成肉眼可见的凝集物，称之为凝集反应。 凝集反应的原理是：抗原与抗体均带负电荷，又皆为亲水胶体，由于同种电荷的相互 排斥及其分子周围的水化膜而呈稳定的胶体溶液。当抗原与抗体特异性结合时，相应的极性 基团（羟基、氨基等）的相互吸附，破坏了水化膜，使亲水胶体变成了憎水胶体；加上存在 的电解质离子会中和一部分负电荷而使抗原抗体相互凝集，形成肉眼可见的凝集物。 1）直接凝集反应。颗粒性抗原与相应抗体直接结合所产生的凝集现象，前者多为细 胞表面的结构成分，如细菌或红细胞的表面结构抗原。 （1）玻片法：多用于抗原的定性检测。将含有已知抗体的诊断血清与待测抗原（细 菌或红细胞） 滴于玻片上混合并摇动，数分钟后出现肉眼可见的凝集物即为阳性反应。此 法简便快速，常用于鉴定细菌和血型。 （2）试管法：多用于抗体的定量检测。在试管中用生理盐水将待检血清作系列倍比 稀释，然后加入等量已知抗原，混匀、振荡后置 37℃过夜，以观察凝集现象。凡最高稀释 度具有明显凝集现象者为该待测血清的效价（或称滴度）。凝集效价表示血清中抗体的含量， 可根据有关抗体含量高低来辅助诊断或作流行病的调查，如诊断伤寒或副伤寒的肥达氏反 应。 2）间接凝集反应。将可溶性抗原吸附于载体颗粒（如乳胶颗粒、红细胞等）的表面， 称之为致敏颗粒。当致敏颗粒与相应抗体结合，即可出现凝集现象。这个反应常用于测定细 菌性抗体、病毒性抗体、钩端螺旋体和梅毒螺旋体抗体及某些自身抗体（如抗核抗体、抗肾 抗体、抗甲状腺抗体等）。 根据凝集反应的原理，还有间接凝集抑制试验、反向间接凝集试验、协同凝集试验等。 2．沉淀反应。可溶性抗原（外毒素、血清、细菌培养的滤液、组织浸出液等）与相 应抗体特异性结合，在电解质参与下，形成沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原多为多 糖、类脂、蛋白质等。 1）单向扩散试验。这是一种抗原定量试验，是可溶性抗原在含抗体的琼脂介质中扩 散的沉淀反应。试验时，将已知抗体与融化的琼脂混匀倾注于平皿或玻片上。琼脂凝固后打 孔，孔内加入待检抗原，置湿盒于室温使其扩散，次日观察结果。由于抗体均匀地分布于琼 脂内，抗原从孔中向四周扩散，抗原抗体复合物在孔周围形成沉淀环。沉淀环的直径与孔中 抗原浓度成正比。如事先用不同浓度的已知标准抗原作单向琼脂扩散，并绘制成抗原浓度与 沉淀环直径的标准曲线，则可根据待检抗原孔的沉淀环直径从标准曲线查明其抗原含量。此 法常用于检测血清免疫球蛋白和补体各成分的含量。 2）双向扩散试验。这是可溶性抗原与抗体在琼脂介质中相互扩散的沉淀反应。将融 化的琼脂倾注于平皿或玻片上，琼脂凝固后打孔，抗原、抗体分别注入孔内，置湿盒内室温 过夜。如抗原与抗体相对应，两者相互扩散可在抗原、抗体孔间呈现清晰的白色沉淀线， 一对抗原与抗体只形成一条沉淀线，几对抗原与抗体则形成几条沉淀线。本法常用于 定性试验，如检测血清免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原等。 3）对流免疫电泳。对流电泳是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫 扩散。在用 pH 8.6 巴比妥缓冲液配制的琼脂板上挖出成对且平行的小孔，将琼脂板放入电 泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗 体，通电后，抗原带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但受琼脂中电渗作用向负 极移动，抗原和抗体能较快集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的白色沉淀线。只需 1 小时左右即可观察结果。此法常用于检测血清中的乙型肝炎表面抗原与甲胎蛋白等。 3．中和试验。特异性抗体可抑制相应抗原物质的活性，抗体使相应抗原的毒性或传 染性消失的反应为中和试验。例如抗毒素中和外毒素的毒性，病毒的中和抗体可使病毒失去 感染性等。诊断风湿热的抗链球菌溶血毒素“O”试验也为一种中和试验。乙型溶血性链球
菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”,该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O” 抗体所中和而不出现溶血。试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合,作用一段时间后加入 人红细胞,红细胞不被溶解为阳性反应,表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。血清 抗体效价达400单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌,有助于风湿热的诊断 4.免疫荧光法(荧光抗体法)。是应用荧光素染料(如异硫氰酸荧光黄等)来标记抗 体,但不影响其活性,此种抗体称荧光抗体。用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的 细胞或组织切片,如有相应抗原存在,则抗原即与此种抗体发生特异性结合,形成复合物而 粘着在细胞上,不易洗脱,在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物,可达到诊断或定位的目 直接法。将已知种类的荧光抗体加到待检标本上,作用半小时后,用缓冲液冲洗, 将未结合的荧光抗体全部洗去,干燥后在荧光显微镜下观察,如发现荧光表明标本中有相应 抗原存在,是为阳性。此法的优点是特异性高,可应用于早期检查病原,如细菌、病毒等 缺点是每检查一种抗原,必须制备与其相应的荧光抗体 2)间接法。先使未标记的已知抗体与待检抗原作用,如待检抗原与已知抗体相对应, 即发生特异性结合成复合物,再加入荧光标记的抗免疫球蛋白(或称抗抗体,能与抗体结合), 由于抗抗体与抗原抗体复合物中的抗体相结合,在荧光显微镜下即能见到荧光,是为阳性 5.酶联免疫吸附试验。本法的原理是利用酶(常用辣根过氧化物酶)标记的抗原或 抗体,以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。有间接法、双抗体法、竞争法三种。 现以间接法为例,简述其检测血清中抗体的基本过程。1)使已知可溶性抗原吸附于 固相载体(聚苯乙烯板凹孔、聚苯乙烯管等)上,孵育后冲洗去未吸附的抗原;2)加待检 血清并孵育,若血清中含有相应抗体,即与吸附的抗原结合,再行冲洗,去除未被结合的抗 体;3)加入酶标记抗球蛋白(抗抗体),使之与抗原抗体复合物上的抗体相结合,再洗涤去 除未吸附的酶标记抗球蛋白:4)加入酶作用底物(二氨基联苯胺,DAB),酶即能分解底 物并显色,用分光光度计检测其显色程度。颜色的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。 6.溶血空斑试验。详见7.13实验的论述。 7.免疫印迹技术。免疫印迹或免疫转印技术( immunoblotting或 Western blot)是在 Southern(1975)创建的DNA印迹术( Southern blotting)基础上发展起来的新型免疫生化 技术。其原理是应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将蛋白质样品分离 后,通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上,并保持其原有的物质类型和生物 学活性不变,然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。由于此项技术具有SDS-PAGE的高 分辨力和固相免疫测定的高度特异性和敏感性,方法简便易行,标本可以长期保存和便于比 较等优点。因此,问世十多年来经过不断改进,已广泛应用于生物学和医学领域,成为免疫 学、微生物学及其它生命科学常用的一种重要研究方法 6.6.1.2细胞免疫检测法 近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术, 不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术,用于检测各类免疫细胞的表面标志(包括抗原 及受体)、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。这些 技术为深入研究和认识机体免疫系统的生理、病理改变,阐明某些疾病的发病机制和临床诊 治提供了有用的手段。随着细胞免疫学的迅猛发展,时有新的细胞免疫检测技术出现。近年 来,新发展的项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面的检测。在中医中药的研究方面, 近年来也得到广泛应用。 淋巴细胞转化试验。人类淋巴细胞在体外与特异性抗原(如结核菌素)或非特异 性有丝分裂原(如植物血凝素,PHA)等一起孵育,T细胞即被激活而向淋巴母细胞转化 T细胞转化过程可伴随有DNA、RNA、蛋白质的合成增加,最后导致细胞分裂。在光学显 微镜下可计数转化后的淋巴母细胞数,也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷(H-TdR)掺入正在 分裂的淋巴细胞,用液闪测定仪来确定掺入量以确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位 素,又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法,称为MIT检测法。MTT是一种甲氮唑 盐,它是细胞线粒体脱氢酶的底物,细胞内的酶可将MIT分解产生蓝黑色成分。该产物的 多少与活细胞数成正比,结果可用酶标仪(595m)测量光密度,作为MTT法的指标 2.E-花环法。人类T细胞表面有羊细胞受体(CD2)能与羊红细胞结合形成玫瑰花样 结构。即将分离液分离出的外周的单个核细胞悬液与羊红细胞在体外混合,经37℃培养5
菌能产生一种溶解人、兔红细胞的溶血毒素“O”，该毒素的溶血毒性可被抗溶血毒素“O” 抗体所中和而不出现溶血。试验时将病人血清与溶血毒素“O”混合，作用一段时间后加入 人红细胞，红细胞不被溶解为阳性反应，表示病人血清中存在抗溶血毒素“O”抗体。血清 抗体效价达 400 单位以上时提示患者曾感染乙型溶血性链球菌，有助于风湿热的诊断。 4. 免疫荧光法（荧光抗体法）。是应用荧光素染料（如异硫氰酸荧光黄等）来标记抗 体，但不影响其活性，此种抗体称荧光抗体。用已知种类的荧光抗体浸染待检的含有抗原的 细胞或组织切片，如有相应抗原存在，则抗原即与此种抗体发生特异性结合，形成复合物而 粘着在细胞上，不易洗脱，在荧光显微镜下成为发出荧光的可见物，可达到诊断或定位的目 的。 1）直接法。将已知种类的荧光抗体加到待检标本上，作用半小时后，用缓冲液冲洗， 将未结合的荧光抗体全部洗去，干燥后在荧光显微镜下观察，如发现荧光表明标本中有相应 抗原存在，是为阳性。此法的优点是特异性高，可应用于早期检查病原，如细菌、病毒等， 缺点是每检查一种抗原，必须制备与其相应的荧光抗体。 2）间接法。先使未标记的已知抗体与待检抗原作用，如待检抗原与已知抗体相对应， 即发生特异性结合成复合物，再加入荧光标记的抗免疫球蛋白（或称抗抗体，能与抗体结合）， 由于抗抗体与抗原抗体复合物中的抗体相结合，在荧光显微镜下即能见到荧光，是为阳性。 5．酶联免疫吸附试验。本法的原理是利用酶（常用辣根过氧化物酶）标记的抗原或 抗体，以测定被检标本中有无相应的抗原或抗体。有间接法、双抗体法、竞争法三种。 现以间接法为例，简述其检测血清中抗体的基本过程。1）使已知可溶性抗原吸附于 固相载体（聚苯乙烯板凹孔、聚苯乙烯管等）上，孵育后冲洗去未吸附的抗原；2）加待检 血清并孵育，若血清中含有相应抗体，即与吸附的抗原结合，再行冲洗，去除未被结合的抗 体；3）加入酶标记抗球蛋白（抗抗体），使之与抗原抗体复合物上的抗体相结合，再洗涤去 除未吸附的酶标记抗球蛋白；4）加入酶作用底物（二氨基联苯胺，DAB），酶即能分解底 物并显色，用分光光度计检测其显色程度。颜色的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。 6．溶血空斑试验。详见 7.13 实验的论述。 7．免疫印迹技术。免疫印迹或免疫转印技术（immunoblotting 或 Western blot）是在 Southern（1975）创建的 DNA 印迹术（Southern blotting）基础上发展起来的新型免疫生化 技术。其原理是应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质样品分离 后，通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上，并保持其原有的物质类型和生物 学活性不变，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测。由于此项技术具有 SDS-PAGE 的高 分辨力和固相免疫测定的高度特异性和敏感性，方法简便易行，标本可以长期保存和便于比 较等优点。因此，问世十多年来经过不断改进，已广泛应用于生物学和医学领域，成为免疫 学、微生物学及其它生命科学常用的一种重要研究方法。 6．6．1．2 细胞免疫检测法 近代免疫学广泛采用了细胞生物学、免疫血清学、免疫标记、免疫组化等多方面技术， 不断发展和完善了一系列细胞免疫检测技术，用于检测各类免疫细胞的表面标志（包括抗原 及受体）、细胞的活化、增殖、吞噬、杀伤功能、各种细胞因子的活性或含量等方面。这些 技术为深入研究和认识机体免疫系统的生理、病理改变，阐明某些疾病的发病机制和临床诊 治提供了有用的手段。随着细胞免疫学的迅猛发展，时有新的细胞免疫检测技术出现。近年 来，新发展的项目集中在对有关细胞因子以及细胞受体方面的检测。在中医中药的研究方面， 近年来也得到广泛应用。 1．淋巴细胞转化试验。人类淋巴细胞在体外与特异性抗原（如结核菌素）或非特异 性有丝分裂原（如植物血凝素，PHA）等一起孵育，T 细胞即被激活而向淋巴母细胞转化。 T 细胞转化过程可伴随有 DNA、RNA、蛋白质的合成增加，最后导致细胞分裂。在光学显 微镜下可计数转化后的淋巴母细胞数，也可用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入正在 分裂的淋巴细胞，用液闪测定仪来确定掺入量以确定淋巴细胞转化率。最近有一种不用同位 素，又可用仪器测量的淋巴细胞增殖反应的检查法，称为 MTT 检测法。MTT 是一种甲氮唑 盐，它是细胞线粒体脱氢酶的底物，细胞内的酶可将 MTT 分解产生蓝黑色成分。该产物的 多少与活细胞数成正比，结果可用酶标仪（595nm）测量光密度，作为 MTT 法的指标。 2．E-花环法。人类 T 细胞表面有羊细胞受体（CD2）能与羊红细胞结合形成玫瑰花样 结构。即将分离液分离出的外周的单个核细胞悬液与羊红细胞在体外混合，经 37℃培养 5～
10分钟后放4℃过夜,取细胞悬液计数,外周血淋巴细胞中约70%~80%淋巴细胞结成花环 即为T细胞,此法可用来分离T细胞。 3.T细胞亚群检测。参考7.14实验 4.细胞毒试验。T细胞、NK细胞、LAK细胞、TL细胞等对其靶细胞有直接的细 胞毒(杀伤)作用。常用的检测方法是5Cr(铬)释放法,将5Cr- Nacro4盐水溶液与靶细 胞(不同的细胞需不同的靶细胞,如NK细胞的靶细胞为K2),于37℃培养1小时左右, slCr即进入靶细胞,与胞浆结合,洗去游离的sCr后,即可得到sCr标记的靶细胞,将待 测细胞毒的细胞与sCr标记的靶细胞混合(比例约为501或100:1),靶细胞杀伤越多,释 放到上清液中的游离scr就越多,且不能再被其他细胞吸收,用γ射线测量仪检测上清液 中的cpm值,可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值 5.巨噬细胞吞噬功能的测定。将中药(10%斑蝥)乙醇浸出液浸渍的滤纸(1cm2大 小)置于受试者前臂屈侧皮肤上,4~5小时后取下滤纸。48小时内皮肤局部可水泡,内含 巨噬细胞。取水泡液0.5m加鸡红细胞悬液001ml,37℃经30分钟后作涂片、染色与镜检, 计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观 察 6.移动抑制试验。致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时,可以产生移动抑制因 子(MF)。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动,使之定位于局部而増强其免 疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后,有无MF产生,以 测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能 常用毛细管法做MF试验,将待测的白细胞悬液装入一端封闭的毛细管内,加入营养 液,37℃经24h观察结果。可看到巨噬细胞或白细胞自毛细管开口端向外移行,形成半圆形 的移行圈,若在营养液中加入一定浓度的特异性抗原,则细胞的移行圈显著缩小,通常用移 行抑制指数表示巨噬细胞或白细胞的抑制情况。 移动指数=加抗原后的巨噬细胞或白细胞移动面积/不加抗原的巨噬细胞或白细胞移 动面积 若移动指数明显小于1,表示机体对该抗原有特异性的细胞免疫作用。 7.时间分辨荧光测量技术。时间分辨荧光测量技术(time- resolved fluorometry,TrF) 是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相 仿,但无放射测量的弊端,故问世虽短,进展却极为迅速,有取代放射测量之势。其基本原 理是,当荧光标记用于免疫分析时,在适宜的条件下,其敏感性可高于核素。但由于被测生 物样品所用溶剂、溶质和存在的一些微粒等的散射光、荧光、磷光及化学发光等的干扰,加 之FITC等荧光物质的激发与发射光波长的重叠,背景干扰很大,致使荧光分析的敏感性可 比原有的下降1/100~1/1000。TrF则以镧系金属元素为示踪物,如Eu+(铕)、Tb3(铽) Sm3+(钐)等与有机螯合剂结合后,经紫外光激发,就能产生特征性的荧光。这种荧光不同 于传统荧光物质的发射光,其特点是:①半衰期长,为普通荧光的103~10°倍;② Stokes 位移较大:③激发光的波长范围较宽,利于提高激发能:;④发射荧光带窄,可降低背景荧光, 提高分辨率;尤其是镧系金属元素激发的荧光具有远较背景物质、普通荧光素所发荧光为长 的衰变时间,通过每次激发后,延缓一段时间再测量等步骤,能最大限度地排除自然本底短 寿命荧光及散射光的干扰 镧系的三价阳离子和蛋白质不能直接结合,故需借特殊螯合剂将常用Eu3等与抗原或 抗体相偶联,使之成为稳定的铕标记蛋白质络合物。一般采用氨基多羧酸衍生物作为双功能 螯合剂,其一端以氨基多羧酸基团通过配位键与Euμ3螯合,另一端经附加的异硫氢酸或重 氮等基团经共价键与抗原或抗体分子上的氨基偶联。这类螯合剂结合Eu3的能力很强,因 而铕标记的络合物比活性很高,利于提高TrF的敏感性 镧系离子-抗原或抗体络合后,在激发光作用下的能量转移较差,产生的荧光强度弱, 故测定前尚需进行增效处理。增效液β-二酮体、3-辛烷基磷化氢的氧化物(TOPO)和 Triton Ⅹ-100组成,pH为32。其作用机制是在酸性环境中,Eu-氨基多羧酸络合物极易解离,游 离的Eu可与增强液中的β-二酮体形成新的络合物。β-二酮体能高效地吸收激发光并能 转移给Eu3。 TritonⅩ-100系非离子型表面活性剂,能溶解脂溶性β-二酮体并形成微囊, 使Eu3与也能吸收β-二酮体转移能量的水分子隔离。TOPO则在Eu+周围形成协同配位 进一步降低配位层中水分子数,使隔离效果更佳。经上述处理后,荧光强度可增加百万倍
10 分钟后放 4℃过夜，取细胞悬液计数，外周血淋巴细胞中约 70%～80%淋巴细胞结成花环 即为 T 细胞，此法可用来分离 T 细胞。 3．T 细胞亚群检测。参考 7.14 实验。 4．细胞毒试验。Tc 细胞、NK 细胞、LAK 细胞、TIL 细胞等对其靶细胞有直接的细 胞毒（杀伤）作用。常用的检测方法是 51Cr（铬）释放法，将 51Cr-Na2CrO4 盐水溶液与靶细 胞（不同的细胞需不同的靶细胞，如 NK 细胞的靶细胞为 K562），于 37℃培养 1 小时左右， 51Cr 即进入靶细胞，与胞浆结合，洗去游离的 51Cr 后，即可得到 51Cr 标记的靶细胞，将待 测细胞毒的细胞与 51Cr 标记的靶细胞混合（比例约为 50:1 或 100:1），靶细胞杀伤越多，释 放到上清液中的游离 51Cr 就越多，且不能再被其他细胞吸收，用γ射线测量仪检测上清液 中的 cpm 值，可计算出待检细胞杀伤活性高低。细胞毒的检测对肿瘤免疫有较大价值。 5．巨噬细胞吞噬功能的测定。将中药（10%斑蝥）乙醇浸出液浸渍的滤纸（1cm2 大 小）置于受试者前臂屈侧皮肤上，4～5 小时后取下滤纸。48 小时内皮肤局部可水泡，内含 巨噬细胞。取水泡液 0.5ml 加鸡红细胞悬液 0.01ml，37℃经 30 分钟后作涂片、染色与镜检， 计算吞噬百分率及每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的平均数。本试验有助于肿瘤病情及疗效的观 察。 6．移动抑制试验。致敏淋巴细胞与其特异性抗原再次接触时，可以产生移动抑制因 子（MIF）。这种因子可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞的移动，使之定位于局部而增强其免 疫作用。本试验用来观察受检者淋巴细胞在体外受特异性抗原刺激后，有无 MIF 产生，以 测定机体对某种抗原的特异性细胞免疫反应的功能。 常用毛细管法做 MIF 试验，将待测的白细胞悬液装入一端封闭的毛细管内，加入营养 液，37℃经 24h 观察结果。可看到巨噬细胞或白细胞自毛细管开口端向外移行，形成半圆形 的移行圈，若在营养液中加入一定浓度的特异性抗原，则细胞的移行圈显著缩小，通常用移 行抑制指数表示巨噬细胞或白细胞的抑制情况。 移动指数＝加抗原后的巨噬细胞或白细胞移动面积/不加抗原的巨噬细胞或白细胞移 动面积 若移动指数明显小于 1，表示机体对该抗原有特异性的细胞免疫作用。 7．时间分辨荧光测量技术。时间分辨荧光测量技术（time-resolved fluorometry, TrF） 是一项新型的超微量非放射性分析技术。该技术的敏感性和特异性与放射性核素测量技术相 仿，但无放射测量的弊端，故问世虽短，进展却极为迅速，有取代放射测量之势。其基本原 理是，当荧光标记用于免疫分析时，在适宜的条件下，其敏感性可高于核素。但由于被测生 物样品所用溶剂、溶质和存在的一些微粒等的散射光、荧光、磷光及化学发光等的干扰，加 之 FITC 等荧光物质的激发与发射光波长的重叠，背景干扰很大，致使荧光分析的敏感性可 比原有的下降 1/100～1/1000。TrF 则以镧系金属元素为示踪物，如 Eu3+（铕）、Tb3+（铽）、 Sm3+（钐）等与有机螯合剂结合后，经紫外光激发，就能产生特征性的荧光。这种荧光不同 于传统荧光物质的发射光，其特点是：①半衰期长，为普通荧光的 103～106 倍；②Stokes 位移较大；③激发光的波长范围较宽，利于提高激发能；④发射荧光带窄，可降低背景荧光， 提高分辨率；尤其是镧系金属元素激发的荧光具有远较背景物质、普通荧光素所发荧光为长 的衰变时间，通过每次激发后，延缓一段时间再测量等步骤，能最大限度地排除自然本底短 寿命荧光及散射光的干扰。 镧系的三价阳离子和蛋白质不能直接结合，故需借特殊螯合剂将常用 Eu3+等与抗原或 抗体相偶联，使之成为稳定的铕标记蛋白质络合物。一般采用氨基多羧酸衍生物作为双功能 螯合剂，其一端以氨基多羧酸基团通过配位键与 Eu3+螯合，另一端经附加的异硫氢酸或重 氮等基团经共价键与抗原或抗体分子上的氨基偶联。这类螯合剂结合 Eu3+的能力很强，因 而铕标记的络合物比活性很高，利于提高 TrF 的敏感性。 镧系离子-抗原或抗体络合后，在激发光作用下的能量转移较差，产生的荧光强度弱， 故测定前尚需进行增效处理。增效液β-二酮体、3-辛烷基磷化氢的氧化物（TOPO）和 Triton X-100 组成，pH 为 3.2。其作用机制是在酸性环境中，Eu3+ -氨基多羧酸络合物极易解离，游 离的 Eu3+ 可与增强液中的β-二酮体形成新的络合物。β-二酮体能高效地吸收激发光并能 转移给 Eu3+ 。Triton X-100 系非离子型表面活性剂，能溶解脂溶性β-二酮体并形成微囊， 使 Eu3+ 与也能吸收β-二酮体转移能量的水分子隔离。TOPO 则在 Eu3+ 周围形成协同配位， 进一步降低配位层中水分子数，使隔离效果更佳。经上述处理后，荧光强度可增加百万倍