极端嗜热硫杆菌浸出黄铁矿

D0I:10.133745.issn1001-053x.2013.07.012 第35卷第7期 北京科技大学学报 Vol.35 No.7 2013年7月 Journal of University of Science and Technology Beijing Jul.2013 极端嗜热硫杆菌浸出黄铁矿 王洪江)，黄明清)☒，王贻明)，吴爱祥)，张旭)，艾纯明) 1)北京科技大学金属矿山高效开采与安全教育部重点实验室，北京1000832)中国科学院微生物研究所，北京100101 通信作者，E-mail:seango@126.com 摘要为了探讨极端嗜热菌在高铁、高酸和高温条件下生物脱硫的可行性，采用从腾冲热海酸性温泉分离出的一株新 型极端嗜热硫杆菌开展了四组不同初始pH值条件下的黄铁矿生物柱浸实验.该菌株能耐受pH值为0.58、全铁质量浓 度为38.9gL-1的高酸高铁环境，同时维持580640mV的较低电位.初始pH值为2时，浸出28d后黄铁矿浸出率 达到最高为17.8%.生物浸出时，菌株生长依次表现出较明显的迟缓期、对数期和稳定期，且降低初始pH值会延长其 到达稳定期的时间.此外，70℃高温和全铁质量浓度为38.9gL一1的高铁体系能促进生成黄钾铁矾和少量单质硫沉淀， 而菌株能在pH值小于0.9时将大部分S°氧化为SO子. 关键词黄铁矿：生物浸矿：生物脱硫：酸性：表面形貌 分类号TF803.21:TD75+2.2 Bioleaching of pyrite by extreme thermophilic Thiobacillus WANG Hong-jiang),HUANG Ming-qing),WANG Yi-ming),WU Ai-riang),ZHANG Xu2), AI Chun-ming 1) 1)Key Laboratory of the Ministry of Education of China for High-Efficient Mining and Safety of Metal Mines,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China 2)Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China Corresponding author,E-mail:seango@126.com ABSTRACT In order to investigate the feasibility of biodesulfurization by an extreme thermophile in high iron concentration,high acidity and elevated temperature environment,four groups of pyrite column bioleaching experiments at variable initial pH values were carried out by using a novel strain of extreme thermophilic Thiobacillus which was isolated from Rehai acidic hot spring in Tengchong in southwestern China.It is found that the new strain is resistant to high acid and high iron environment in which the pH value is 0.58 and the soluble iron concentration is 38.9 g-L, while the redox potential maintains at a low level from 580 to 640 mV.The highest value of iron recovery can reach up to 17.8%after leaching for 28 d when the initial pH value is 2.The bacterial growth evidently represents a lag phase,a logarithmic phase and a stationary phase sequentially in the traditional bioleaching route,while reducing the initial pH value can prolong the time of reaching the steady periodical.In addition,precipitation formation of jarosite and a little sulfur is promoted in the high iron system of which the total iron concentration is 38.9 gL and the temperature is 70 C.The novel strain can oxidize the majority of So to SO even when the pH value is lower than 0.9. KEY WORDS pyrites;bioleaching;biodesulfurization;acidity:surface morphology 作为世界上分布最广泛的矿物，硫化矿一直5%~10%的有色金属矿有内因火灾倾向口.事实上， 是金、铜等金属的重要来源.我国的金属矿山中 当硫化矿中含硫质量分数大于15%时，硫化矿的开 约有1/3含硫量偏高，其中20%30%的硫铁矿及 采、运输和堆浸过程中便容易产生自热甚至自燃现 收稿日期：2012-03-04 基金项目：国家自然科学基金资助项目(50934002,51074013)：新世纪优秀人才支持计划资助项目(NECT-07-0070):教育部长江 学者和创新团队发展计划资助项目(IRT0950)

第 35 卷 第 7 期 北 京 科 技 大 学 学 报 Vol. 35 No. 7 2013 年 7 月 Journal of University of Science and Technology Beijing Jul. 2013 极端嗜热硫杆菌浸出黄铁矿 王洪江1)，黄明清1) ，王贻明1)，吴爱祥1)，张 旭2)，艾纯明1) 1) 北京科技大学金属矿山高效开采与安全教育部重点实验室，北京 100083 2) 中国科学院微生物研究所，北京 100101 通信作者，E-mail: seango@126.com 摘 要 为了探讨极端嗜热菌在高铁、高酸和高温条件下生物脱硫的可行性，采用从腾冲热海酸性温泉分离出的一株新 型极端嗜热硫杆菌开展了四组不同初始 pH 值条件下的黄铁矿生物柱浸实验. 该菌株能耐受 pH 值为 0.58、全铁质量浓 度为 38.9 g·L −1 的高酸高铁环境，同时维持 580∼640 mV 的较低电位. 初始 pH 值为 2 时，浸出 28 d 后黄铁矿浸出率 达到最高为 17.8%. 生物浸出时，菌株生长依次表现出较明显的迟缓期、对数期和稳定期，且降低初始 pH 值会延长其 到达稳定期的时间. 此外，70 ℃高温和全铁质量浓度为 38.9 g·L −1 的高铁体系能促进生成黄钾铁矾和少量单质硫沉淀， 而菌株能在 pH 值小于 0.9 时将大部分 S 0 氧化为 SO2− 4 . 关键词 黄铁矿；生物浸矿；生物脱硫；酸性；表面形貌 分类号 TF803.21; TD75+2.2 Bioleaching of pyrite by extreme thermophilic Thiobacillus WANG Hong-jiang 1), HUANG Ming-qing 1) , WANG Yi-ming 1), WU Ai-xiang 1), ZHANG Xu 2) , AI Chun-ming 1) 1) Key Laboratory of the Ministry of Education of China for High-Efficient Mining and Safety of Metal Mines, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China 2) Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China Corresponding author, E-mail: seango@126.com ABSTRACT In order to investigate the feasibility of biodesulfurization by an extreme thermophile in high iron concentration, high acidity and elevated temperature environment, four groups of pyrite column bioleaching experiments at variable initial pH values were carried out by using a novel strain of extreme thermophilic Thiobacillus which was isolated from Rehai acidic hot spring in Tengchong in southwestern China. It is found that the new strain is resistant to high acid and high iron environment in which the pH value is 0.58 and the soluble iron concentration is 38.9 g·L −1 , while the redox potential maintains at a low level from 580 to 640 mV. The highest value of iron recovery can reach up to 17.8% after leaching for 28 d when the initial pH value is 2. The bacterial growth evidently represents a lag phase, a logarithmic phase and a stationary phase sequentially in the traditional bioleaching route, while reducing the initial pH value can prolong the time of reaching the steady periodical. In addition, precipitation formation of jarosite and a little sulfur is promoted in the high iron system of which the total iron concentration is 38.9 g·L −1 and the temperature is 70 ℃. The novel strain can oxidize the majority of S0 to SO2− 4 even when the pH value is lower than 0.9. KEY WORDS pyrites; bioleaching; biodesulfurization; acidity; surface morphology 作为世界上分布最广泛的矿物，硫化矿一直 是金、铜等金属的重要来源. 我国的金属矿山中 约有 1/3 含硫量偏高，其中 20%∼30%的硫铁矿及 5%∼10%的有色金属矿有内因火灾倾向[1] . 事实上， 当硫化矿中含硫质量分数大于 15%时，硫化矿的开 采、运输和堆浸过程中便容易产生自热甚至自燃现 收稿日期：2012–03–04 基金项目：国家自然科学基金资助项目 (50934002，51074013)；新世纪优秀人才支持计划资助项目 (NECT-07-0070)；教育部长江 学者和创新团队发展计划资助项目 (IRT0950) DOI:10.13374/j.issn1001-053x.2013.07.012

第7期 王洪江等：极端嗜热硫杆菌浸出黄铁矿 ,851. 象，给生产和人员安全带来隐患.有学者认为通过 高铁、高酸和高温体系中生物脱硫的可行性 生物脱硫能明显降低硫化矿的含硫量，进而抑制硫 化矿内因火灾2-到.生物脱硫的本质是利用浸矿微 1材料与方法 生物的氧化作用将矿石中的固态还原性硫氧化成可 1.1矿样 溶性的硫酸盐，进而减少矿石表面的含硫量.Yi 矿样由安徽新桥铁矿提供，原矿经颚式破碎机 等囚利用At.ferrooridans处理安徽新桥硫铁矿， 破碎后用振动筛筛分成粒径为2~10mm的颗粒，用 矿石中硫的浸出率高于35%，且浸出后矿石的自燃 密封袋保存备用.X射线衍射仪（型号：日本Rigaku 倾向性从I级降为Ⅲ级.吴爱祥等4进一步提出一 D/MAX-RB)分析表明，矿石成分较简单，主要为 种细菌浸出治理硫化矿石自燃的方法，通过向井下 胶状黄铁矿和石英.原矿中Fe、S和SiO2的质量分 矿堆喷洒含菌溶液及洗涤矿石降低矿石含硫量，从 数分别为40.13%、45.87%及14% 而实现了高硫矿石的安全开采 1.2菌种分离与测序 目前，生物脱硫的目标物质主要是黄铁矿，而 从云南腾冲热海温泉中取菌种进行培养，取样 黄铁矿经常以伴生矿、共生矿形式出现在各类硫化 点水温90℃，pH2.5.在无菌操作台中，将20mL 矿中.然而，一方面，由于硫化矿的氧化过程是放 菌液接种到含180mL培养基的300mL锥形瓶，并 热反应，利用生物脱硫时必然在矿堆和浸出液中聚 置于温度70℃、转速50r~min-1的恒温振荡器中进 焦大量热量，温度可能升高至不利于浸矿细菌生长 行培养.培养7~10d后，接种10%（体积分数）培养 的范围：另一方面，黄铁矿的浸出是一个增铁产酸 后的菌液进行下一代富集及转代培养；如此转接 过程，浸出时不断降低的溶液pH值也将影响细菌五代，得到较纯的菌种.培养基化学成分如下： 的活性.Ruan等利用中度嗜热细菌和嗜中温细菌 (NH4)2S043.0gL-1,K2HP040.5g-L-1,MgsO4 群浸出含5.8%（质量分数）黄铁矿的次生硫化铜矿， 7H200.5gL-1,KCl0.1gL-1,Ca(N03)20.01 发现浸出富液温度达4560℃，pH值低至0.8~1.0， gL-1,S01.0gL-1，酵母提取物0.01%（质量分 而堆内温度高达70℃，这种苛刻的条件降低了细菌 数)：培养液pH2.5.富集及转代培养后得到的菌液， 的活性和浸矿性能同.此外，浸矿微生物主要有嗜 按同样的方法进行三代驯化培养，但三代培养中培 中温细菌、中度嗜热细菌和极端嗜热菌，其中嗜中 养基中单质硫粉S质量浓度依次设为1.0、0.5及 温细菌生长最适温度为30~45℃、pH值为2.0~3.5， 0gL-1，酵母提取物质量浓度依次设为0.2、0.1及 中度嗜热细菌生长最适温度为40~55℃、pH值为 0gL-1,且同时加入10%（质量分数）黄铁矿粉.菌 1.53.0,均难以适应高铁、高酸和高温的浸矿环境. 种鉴定时，取适量处于对数期的极端嗜热菌液进行 因此，开展极端嗜热菌在低pH值环境中浸出硫化 细菌DNA提取、16 S rDNA PCR扩增及测序：然 矿特别是黄铁矿的研究，能为硫化矿生物脱硫提供 后将所测得的l6 S rDNA序列提交至GenBank数 有价值的参考. 据库，采用BLAST法与近缘菌株的基因序列作比 近年来，生物冶金的学者开展了一系列极端嗜 对：再从数据库获得相关属、种的16 S rDNA序列， 热菌浸出硫化矿的研究.如Mousavi等间认为Acid- 建立基因系统发育进化树 ianus brierleyi,,Sulfolobus acidocaldarius等古生菌能 1.3实验方案 在5590℃温度范围以及较低pH值条件下浸出硫 开展四组(C1、C2、C3和C4)不同初始pH值 化矿：Xia等)发现pH值为0.8、温度为65℃时极 条件下的极端嗜热菌浸出黄铁矿柱浸实验.溶浸液 端嗜热菌Acidianus manzaensis仍能有效浸出黄铁 初始pH值依次为1.0、1.5、2.0和2.5.浸柱材料为 矿：陈家武等8认为嗜高温细菌对高铁浓度环境有 树脂玻璃，玻璃柱高500mm,内径50mm,内径与 更强的抗性和适应性，且高温条件下的生物浸出在 外径之间为5mm的保温夹层，夹层用橡胶管与恒 动力学和热力学上比常温浸出更具优势.然而，国 温水浴连接.首先，往浸柱中分别装矿1600g(矿石 内外应用极端嗜热菌进行生物脱硫的研究仍然较少 层高350mm),矿石粒径为24mm,矿石层上方铺 见于公开报道.基于以上分析，本文首先从腾冲温 200g砾石颗粒（砾石层高40mm),以利于溶液均匀 泉中分离出一株适应高铁和高酸环境的极端嗜热菌 渗透.其次，用蒸馏水冲洗矿石，以清除矿石表面可 株，其次开展四组不同初始pH值条件下的黄铁矿 能的氧化物杂质.再次，控制恒温水浴泵，使浸柱 生物柱浸实验，再从铁的浸出、细菌活性和矿物表 夹层中的水温在实验周期内始终保持在(70士3)℃ 面形貌等角度观察浸出效果，以探讨极端嗜热菌在 进液箱中为接种量15%（体积分数）的含菌溶液，在

第 7 期 王洪江等：极端嗜热硫杆菌浸出黄铁矿 851 ·· 象，给生产和人员安全带来隐患. 有学者认为通过 生物脱硫能明显降低硫化矿的含硫量，进而抑制硫 化矿内因火灾[2−3] . 生物脱硫的本质是利用浸矿微 生物的氧化作用将矿石中的固态还原性硫氧化成可 溶性的硫酸盐，进而减少矿石表面的含硫量. Yin 等[2] 利用 At. ferrooxidans 处理安徽新桥硫铁矿， 矿石中硫的浸出率高于 35%，且浸出后矿石的自燃 倾向性从Ⅰ级降为Ⅲ级. 吴爱祥等[4] 进一步提出一 种细菌浸出治理硫化矿石自燃的方法，通过向井下 矿堆喷洒含菌溶液及洗涤矿石降低矿石含硫量，从 而实现了高硫矿石的安全开采. 目前，生物脱硫的目标物质主要是黄铁矿，而 黄铁矿经常以伴生矿、共生矿形式出现在各类硫化 矿中. 然而，一方面，由于硫化矿的氧化过程是放 热反应，利用生物脱硫时必然在矿堆和浸出液中聚 焦大量热量，温度可能升高至不利于浸矿细菌生长 的范围；另一方面，黄铁矿的浸出是一个增铁产酸 过程，浸出时不断降低的溶液 pH 值也将影响细菌 的活性. Ruan 等利用中度嗜热细菌和嗜中温细菌 群浸出含5.8% (质量分数) 黄铁矿的次生硫化铜矿， 发现浸出富液温度达45∼60 ℃，pH 值低至 0.8∼1.0， 而堆内温度高达 70 ℃，这种苛刻的条件降低了细菌 的活性和浸矿性能[5] . 此外，浸矿微生物主要有嗜 中温细菌、中度嗜热细菌和极端嗜热菌，其中嗜中 温细菌生长最适温度为 30∼45 ℃、pH 值为 2.0∼3.5， 中度嗜热细菌生长最适温度为 40∼55 ℃、pH 值为 1.5∼3.0，均难以适应高铁、高酸和高温的浸矿环境. 因此，开展极端嗜热菌在低 pH值环境中浸出硫化 矿特别是黄铁矿的研究，能为硫化矿生物脱硫提供 有价值的参考. 近年来，生物冶金的学者开展了一系列极端嗜 热菌浸出硫化矿的研究. 如 Mousavi 等[6] 认为 Acid￾ianus brierleyi, Sulfolobus acidocaldarius 等古生菌能 在 55∼90 ℃温度范围以及较低 pH 值条件下浸出硫 化矿；Xia 等[7] 发现 pH 值为 0.8、温度为 65 ℃时极 端嗜热菌 Acidianus manzaensis 仍能有效浸出黄铁 矿；陈家武等[8] 认为嗜高温细菌对高铁浓度环境有 更强的抗性和适应性，且高温条件下的生物浸出在 动力学和热力学上比常温浸出更具优势. 然而，国 内外应用极端嗜热菌进行生物脱硫的研究仍然较少 见于公开报道. 基于以上分析，本文首先从腾冲温 泉中分离出一株适应高铁和高酸环境的极端嗜热菌 株，其次开展四组不同初始 pH 值条件下的黄铁矿 生物柱浸实验，再从铁的浸出、细菌活性和矿物表 面形貌等角度观察浸出效果，以探讨极端嗜热菌在 高铁、高酸和高温体系中生物脱硫的可行性. 1 材料与方法 1.1 矿样 矿样由安徽新桥铁矿提供，原矿经颚式破碎机 破碎后用振动筛筛分成粒径为 2∼10 mm 的颗粒，用 密封袋保存备用. X 射线衍射仪 (型号：日本 Rigaku D/MAX-RB) 分析表明，矿石成分较简单，主要为 胶状黄铁矿和石英. 原矿中 Fe、S 和 SiO2 的质量分 数分别为 40.13%、45.87%及 14%. 1.2 菌种分离与测序 从云南腾冲热海温泉中取菌种进行培养，取样 点水温 90 ℃，pH 2.5. 在无菌操作台中，将 20 mL 菌液接种到含 180 mL 培养基的 300 mL 锥形瓶，并 置于温度 70 ℃、转速 50 r·min−1 的恒温振荡器中进 行培养. 培养 7∼10 d 后，接种 10% (体积分数) 培养 后的菌液进行下一代富集及转代培养；如此转接 五代，得到较纯的菌种. 培养基化学成分如下： (NH4)2SO4 3.0 g·L −1，K2HPO4 0.5 g·L −1，MgSO4· 7 H2O 0.5 g·L −1，KCl 0.1 g·L −1，Ca(NO3)2 0.01 g·L −1，S 0 1.0 g·L −1，酵母提取物 0.01% (质量分 数)；培养液 pH 2.5. 富集及转代培养后得到的菌液， 按同样的方法进行三代驯化培养，但三代培养中培 养基中单质硫粉 S 0 质量浓度依次设为 1.0、0.5 及 0 g·L −1，酵母提取物质量浓度依次设为 0.2、0.1 及 0 g·L −1，且同时加入 10% (质量分数) 黄铁矿粉. 菌 种鉴定时，取适量处于对数期的极端嗜热菌液进行 细菌 DNA 提取、16S rDNA PCR 扩增及测序；然 后将所测得的 16S rDNA 序列提交至 GenBank 数 据库，采用 BLAST 法与近缘菌株的基因序列作比 对；再从数据库获得相关属、种的 16S rDNA 序列， 建立基因系统发育进化树. 1.3 实验方案 开展四组 (C1、C2、C3 和 C4) 不同初始 pH 值 条件下的极端嗜热菌浸出黄铁矿柱浸实验. 溶浸液 初始 pH 值依次为 1.0、1.5、2.0 和 2.5. 浸柱材料为 树脂玻璃，玻璃柱高 500 mm，内径 50 mm，内径与 外径之间为 5 mm 的保温夹层，夹层用橡胶管与恒 温水浴连接. 首先，往浸柱中分别装矿 1600 g (矿石 层高 350 mm)，矿石粒径为 2∼4 mm，矿石层上方铺 200 g 砾石颗粒 (砾石层高 40 mm)，以利于溶液均匀 渗透. 其次，用蒸馏水冲洗矿石，以清除矿石表面可 能的氧化物杂质. 再次，控制恒温水浴泵，使浸柱 夹层中的水温在实验周期内始终保持在 (70±3) ℃. 进液箱中为接种量 15% (体积分数) 的含菌溶液，在

,852 北京科技大学学报 第35卷 重力作用下，含菌溶液以约160Lm-2h-1速率流 布10.前人曾分离出多株极端嗜热菌，如球状硫化 经矿石层并与其发生反应，浸出富液从玻璃柱底部 叶菌(Sulfolobus tengchongensis,T=75℃，pH3.5)、 经橡胶管流入出液箱.当进液箱溶液即将消耗完时， 杆状极端嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophi- 用蠕动泵将出液箱中浸出富液抽至进液箱进行循环 lus,T=8596℃，pH3.5)及球状极端嗜热古生菌 浸出. (Acidianus manzaen.si,T=65℃，pH1.5)等10-12， 1.4检测方法 本实验菌种与上述菌种，特别是Xia、He等7,12得 每4d用移液管抽取5mL浸出富液进行分析， 到的Acidianus manzaensis在生长温度、耐受酸度 取样损失以蒸馏水补偿.pH值及氧化还原电位采用 及能源获取方式等习性相近，为本研究提供了参考. SX-620型pH计测量（参照电极为Ag/AgCI):Fe2+ Acidianus manzaen.sis呈球状，能在T=65℃、pH1.5 离子浓度采用以二苯铵磺酸钠为指示剂的络合滴定 时促进黄铜矿和黄铁矿等硫化矿的溶解，其中浸出 法测量：总铁T℉e浓度采用SmCl2还原法将溶液中 黄铁矿时溶液中最终T℉e质量浓度为3gL-1,且 可溶性铁还原成Fe2+离子，再进行络合滴定：TFe 电位E.维持在300~450mV之间：而本实验菌株 和Fe2+离子浓度差值即为Fe3+离子浓度9.SO 呈短杆状，在T=70℃、pH2.0时浸出黄铁矿，检 离子浓度采用DX-120型离子色谱仪检测. 测到浸出富液中最终T℉e质量浓度为40gL-1,且 电位E维持在590650mV范围.结果表明两者 2结果与讨论 在细菌形貌及浸矿性能等方面存在差异，即本实验 2.1菌种鉴定 分离得到的极端嗜热硫杆菌是一种新型浸矿菌株. BLAST序列比对法表明，该菌株与Genbank 数据库中登录号为GQ062358.1的菌种基因序列相 似性达98%，两序列的同源性可靠性的评价值E为 0.进一步对比该菌与同源性较高的20株硫杆菌的 16 S rDNA,并利用软件Mega3.1构建其系统发育树 (图1)，可确定该极端嗜热菌为硫杆菌属 g238282058gbGQ062436.1 5238280144b1000522.1 i238281940gbGQ062318.1 2 i238281931gbGQ062309.1 =238281821g史G9062199.1 j238281863g 2 -238282032gbG0062410.1 833888:1 g23828206 062442. 62 238281901bGQ062279.1 302030918 gb HM595400.1 T38601165g5AY376698.1 238281874gb6GQ062252.1 图2极端嗜热硫杆菌扫描电镜像 i238282065gbGQ062443.1 238282043gbGQ062421.1 gm238281980gbGQ062358.1 Fig.2 SEM image of the extreme thermophilic Thiobacillus Target 图1极端嗜热硫杆菌16 S rDNA基因系统发育进化树 2.2不同浸出富液pH值及电位变化规律 Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of the ex- 黄铁矿生物浸出富液的pH值及氧化还原电位 treme thermophilic Thiobacillus 随时间的变化曲线如图3所示.从图中可以看出， 对极端嗜热硫杆菌进行扫描电镜(SEM)分析， 在28d的生物浸出中，四组浸出富液pH值的变化 结果见图2.从图2可看出，该菌株呈短杆状，个体 趋势类似，即在前16d开始急剧下降，此后稳中有 大小比较平均，直径为12um.菌株革兰氏染色为 降，但总体上趋于平稳，最终pH值稳定在0.61.06 阴性.转代和驯化培养实验表明，该菌最适生长pH 具体原因为在浸出前期，富液中能源和氧气充足， 值为2.0，最适生长温度为70℃，在纯培养基中生 此时黄铁矿在细菌的催化作用下迅速氧化，并产生 长周期为17d,能以元素硫、Fe2+离子作为生长能 大量的酸（见式(1）(3)，因此导致富液的pH值急 源，并能耐受T℉e的最大质量浓度为40gL-1. 剧下降：而在浸出16d后，由于浸出体系中细菌繁 腾冲热海温泉水温5593℃，pH1.56.0, 殖与死亡数量达到动态平衡，将2+离子氧化为 水化学特征差异明显，嗜温菌种可能呈多样性分 Fe3+离子的速度减缓，黄铁矿的化学浸出和产酸量

· 852 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 35 卷 重力作用下，含菌溶液以约 160 L·m−2 ·h −1 速率流 经矿石层并与其发生反应，浸出富液从玻璃柱底部 经橡胶管流入出液箱. 当进液箱溶液即将消耗完时， 用蠕动泵将出液箱中浸出富液抽至进液箱进行循环 浸出. 1.4 检测方法 每 4 d 用移液管抽取 5 mL 浸出富液进行分析， 取样损失以蒸馏水补偿. pH 值及氧化还原电位采用 SX-620 型 pH 计测量 (参照电极为 Ag/AgCl)；Fe2+ 离子浓度采用以二苯铵磺酸钠为指示剂的络合滴定 法测量；总铁 TFe 浓度采用 SnCl2 还原法将溶液中 可溶性铁还原成 Fe2+ 离子，再进行络合滴定；TFe 和 Fe2+ 离子浓度差值即为 Fe3+ 离子浓度[9]. SO2− 4 离子浓度采用 DX-120 型离子色谱仪检测. 2 结果与讨论 2.1 菌种鉴定 BLAST 序列比对法表明，该菌株与 Genbank 数据库中登录号为 GQ062358.1 的菌种基因序列相 似性达 98%，两序列的同源性可靠性的评价值 E 为 0. 进一步对比该菌与同源性较高的 20 株硫杆菌的 16S rDNA，并利用软件 Mega3.1 构建其系统发育树 (图 1)，可确定该极端嗜热菌为硫杆菌属. 图 1 极端嗜热硫杆菌 16S rDNA 基因系统发育进化树 Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences of the ex￾treme thermophilic Thiobacillus 对极端嗜热硫杆菌进行扫描电镜 (SEM) 分析， 结果见图 2. 从图 2 可看出，该菌株呈短杆状，个体 大小比较平均，直径为 1∼2 µm. 菌株革兰氏染色为 阴性. 转代和驯化培养实验表明，该菌最适生长 pH 值为 2.0，最适生长温度为 70 ℃，在纯培养基中生 长周期为 17 d，能以元素硫、Fe2+ 离子作为生长能 源，并能耐受 TFe 的最大质量浓度为 40 g·L −1 . 腾冲热海温泉水温 55∼93 ℃， pH 1.5∼6.0， 水化学特征差异明显，嗜温菌种可能呈多样性分 布[10] . 前人曾分离出多株极端嗜热菌，如球状硫化 叶菌 (Sulfolobus tengchongensis, T=75 ℃，pH 3.5)、 杆状极端嗜热芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophi￾lus, T=85∼96 ℃，pH 3.5) 及球状极端嗜热古生菌 (Acidianus manzaensis, T=65 ℃，pH 1.5) 等[10−12] . 本实验菌种与上述菌种，特别是 Xia、He 等[7,12] 得 到的 Acidianus manzaensis 在生长温度、耐受酸度 及能源获取方式等习性相近，为本研究提供了参考. Acidianus manzaensis 呈球状，能在 T=65 ℃、pH 1.5 时促进黄铜矿和黄铁矿等硫化矿的溶解，其中浸出 黄铁矿时溶液中最终 TFe 质量浓度为 3 g·L −1，且 电位 Eh 维持在 300∼450 mV 之间；而本实验菌株 呈短杆状，在 T=70 ℃、pH 2.0 时浸出黄铁矿，检 测到浸出富液中最终 TFe 质量浓度为 40 g·L −1，且 电位 Eh 维持在 590∼650 mV 范围. 结果表明两者 在细菌形貌及浸矿性能等方面存在差异，即本实验 分离得到的极端嗜热硫杆菌是一种新型浸矿菌株. 图 2 极端嗜热硫杆菌扫描电镜像 Fig.2 SEM image of the extreme thermophilic Thiobacillus 2.2 不同浸出富液 pH 值及电位变化规律 黄铁矿生物浸出富液的 pH 值及氧化还原电位 随时间的变化曲线如图 3 所示. 从图中可以看出， 在 28 d 的生物浸出中，四组浸出富液 pH 值的变化 趋势类似，即在前 16 d 开始急剧下降，此后稳中有 降，但总体上趋于平稳，最终 pH 值稳定在 0.6∼1.06. 具体原因为在浸出前期，富液中能源和氧气充足， 此时黄铁矿在细菌的催化作用下迅速氧化，并产生 大量的酸 (见式 (1)∼(3))，因此导致富液的 pH 值急 剧下降；而在浸出 16 d 后，由于浸出体系中细菌繁 殖与死亡数量达到动态平衡，将 Fe2+ 离子氧化为 Fe3+ 离子的速度减缓，黄铁矿的化学浸出和产酸量

第7期 王洪江等：极端嗜热硫杆菌浸出黄铁矿 853· 受到抑制，故pH值呈缓慢下降 中累积较多的T℉e和Fe3+离子，黄铁矿在生物-化 FeS2+6Fe3++3H20-一7Fe2++S203-+6H+,(1) 学浸出作用下溶解速率较高：而此后细菌进入稳定 期，细菌数量及其氧化能力不再增加，溶液中TF S202-+8Fe3++5H20-一2S02-+8Fe2++10H+,(2) 浓度、Fe3+离子浓度和Fe2+离子浓度均保持相对 4Fe2++02+4H+细菌4Fe3++2H20. (3) 稳定，故浸出率也进入上升缓慢相对稳定期.四组 此外从图中也可看出，四组实验中浸出富液的 实验中C3的铁浸出率最高(17.8%)，其余三组较接 氧化还原电位都在前16天小幅上升，此后缓慢降 近(11.4%13.9%).这与前期细菌驯化实验相符，即 低，最终电位维持在相对低水平的580640mV.由 极端嗜热硫杆菌的最适生长及浸矿的初始pH值为 能斯特方程可知，电位主要取决于溶液中Fe3+离子 2.0.由图可以看出C1和C2组第20天后进入稳定 期，而C3和C4组第16天后进入稳定期，说明菌 与F2+离子的比值，而该比值又与细菌数量及氧化 能力有关.由上文可知第16天后富液中Fe3+离子 株生长和浸矿对初始pH值敏感.此外，结合图3 及图4(a)可看出，尽管C1组最终pH值仅为0.58， 与F2+离子的比值开始下降，验证了富液中氧化还 却仍能观察到细菌对黄铁矿的氧化作用，表明菌株 原电位缓慢降低这一现象，同时也进一步说明细菌 能在70℃时适应较高的酸性环境. 生长已进入稳定期或衰亡期.此外，浸出富液的低 2.4浸出前后矿石表面形貌对比 电位与接种极端嗜热硫杆菌需要维持较高的浸出温 度(70℃)有关，通常高温会降低浸出体系电位3)， 图5为C3组生物浸出前后的黄铁矿颗粒表面 这可能是因为高温促进了e3+离子与K+、SO? 的扫描电镜图像对比图.图5(a)表明，浸出前颗 等离子反应生成沉淀或Fe3+离子在矿物颗粒表面 粒表面相对致密，晶形规整：而图5(b)显示，浸 上的吸附，从而降低了Fe3+离子与Fe2+离子的比 出后矿石晶形破坏、孔裂隙发育和扩展明显，并在 值 晶簇间形成大小不一的溶蚀坑，颗粒表面出现少量 疏松多孔的沉淀.刊矿石表面形貌发生这些演化，是 ■ 2.5p 因为随着浸出的进行，浸矿细菌不断附着在颗粒表 600 2.0 面，或沿矿物裂隙进入矿石内部，并通过直接作用 pH值 电位 或间接作用机理与矿物发生反应，促进了黄铁矿的 溶解. 1.0 ◆ 图6为不同初始pH值时浸出富液中SO及 ■ 0.5 ■ 4508 T℉e浓度增加值及其拟合线，拟合线斜率即为SO子 及TFe浓度增加值之比.四组中SO-及TFe浓度 0.0 0 101520 5 30 增加值之比分别为2.85(C1)、1.88(C2)、1.54(C3)及 浸出时间/d 图3浸出时间对黄铁矿生物浸出富液pH值及氧化还原电 1.81(C4).黄铁矿通过硫代硫酸盐途径溶解，生成 位的影响 的S2O等中间产物在细菌催化下全部或部分氧 化成SO2.FeS2中元素摩尔比为S:Fe=2:1,如果 Fig.3 Effects of leaching time on the pH values and redox 黄铁矿溶解产物不发生二次反应，且中间产物全部 potential in pregnant leaching solutions of pyrite bioleaching 氧化成SO,则浸出液中增加的离子浓度比理论 2.3初始pH值对黄铁矿浸出效果的影响 值也应为SO2-:Fe=2:1.实验中四组SO2-与TFe 不同初始pH值下浸出时间对浸出富液中Fe3+ 增加的浓度比SO2ˉ：TFe的观测值与理想值的差值 离子浓度、Fe2+离子浓度、TFe浓度以及黄铁矿浸 亦可通过拟合直线的斜率表示，拟合直线斜率越接 出率的影响如图4所示.四种初始pH值下黄铁矿 近2，表明理想值与观测值偏差越小，否则偏差较 浸出率变化趋势相近，均随富液中可溶性总铁浓度 大。通过图6可以看到，四组SO与Te增加 的升高而升高，按浸出速率的不同可分为前8天、 的浓度比SO子：T℉e的观测值的拟合直线的斜率 第8~20天(C1、C2)或第816天(C3、C4)及以 为1.81~2.85，说明其观测与理想值存在一定偏差， 后第三阶段.前8d为细菌生长的迟缓期，黄铁矿 具体原因可能为Fe3+、SO等离子都参与了沉淀 溶解途径主要是化学反应，但由于黄铁矿属于酸难 反应14.用电子探针进一步分析颗粒表面沉淀，检 溶性矿石，故此时浸出速率有限；第820天或第 测出其主要成分为黄钾铁矾，此外还有少量的单质 816天为对数期，此时细菌增殖很快，在浸出液 硫

第 7 期 王洪江等：极端嗜热硫杆菌浸出黄铁矿 853 ·· 受到抑制，故 pH 值呈缓慢下降. FeS2 + 6Fe3+ + 3H2O −→ 7Fe2+ + S2O 2− 3 + 6H+, (1) S2O 2− 3 +8Fe3++5H2O −→ 2SO2− 4 +8Fe2+ +10H+, (2) 4Fe2+ + O2 + 4H+ 细菌−→ 4Fe3+ + 2H2O. (3) 此外从图中也可看出，四组实验中浸出富液的 氧化还原电位都在前 16 天小幅上升，此后缓慢降 低，最终电位维持在相对低水平的 580∼640 mV. 由 能斯特方程可知，电位主要取决于溶液中 Fe3+ 离子 与 Fe2+ 离子的比值，而该比值又与细菌数量及氧化 能力有关. 由上文可知第 16 天后富液中 Fe3+ 离子 与 Fe2+ 离子的比值开始下降，验证了富液中氧化还 原电位缓慢降低这一现象，同时也进一步说明细菌 生长已进入稳定期或衰亡期. 此外，浸出富液的低 电位与接种极端嗜热硫杆菌需要维持较高的浸出温 度 (70 ℃) 有关，通常高温会降低浸出体系电位[13]， 这可能是因为高温促进了 Fe3+ 离子与 K+、SO2− 4 等离子反应生成沉淀或 Fe3+ 离子在矿物颗粒表面 上的吸附，从而降低了 Fe3+ 离子与 Fe2+ 离子的比 值. 图 3 浸出时间对黄铁矿生物浸出富液 pH 值及氧化还原电 位的影响 Fig.3 Effects of leaching time on the pH values and redox potential in pregnant leaching solutions of pyrite bioleaching 2.3 初始 pH 值对黄铁矿浸出效果的影响 不同初始 pH 值下浸出时间对浸出富液中 Fe3+ 离子浓度、Fe2+ 离子浓度、TFe 浓度以及黄铁矿浸 出率的影响如图 4 所示. 四种初始 pH 值下黄铁矿 浸出率变化趋势相近，均随富液中可溶性总铁浓度 的升高而升高，按浸出速率的不同可分为前 8 天、 第 8∼20 天 (C1、C2) 或第 8∼16 天 (C3、C4) 及以 后第三阶段. 前 8 d 为细菌生长的迟缓期，黄铁矿 溶解途径主要是化学反应，但由于黄铁矿属于酸难 溶性矿石，故此时浸出速率有限；第 8∼20 天或第 8∼16 天为对数期，此时细菌增殖很快，在浸出液 中累积较多的 TFe 和 Fe3+ 离子，黄铁矿在生物–化 学浸出作用下溶解速率较高；而此后细菌进入稳定 期，细菌数量及其氧化能力不再增加，溶液中 TFe 浓度、Fe3+ 离子浓度和 Fe2+ 离子浓度均保持相对 稳定，故浸出率也进入上升缓慢相对稳定期. 四组 实验中 C3 的铁浸出率最高 (17.8%)，其余三组较接 近 (11.4%∼13.9%). 这与前期细菌驯化实验相符，即 极端嗜热硫杆菌的最适生长及浸矿的初始 pH 值为 2.0. 由图可以看出 C1 和 C2 组第 20 天后进入稳定 期，而 C3 和 C4 组第 16 天后进入稳定期，说明菌 株生长和浸矿对初始 pH 值敏感. 此外，结合图 3 及图 4(a) 可看出，尽管 C1 组最终 pH 值仅为 0.58， 却仍能观察到细菌对黄铁矿的氧化作用，表明菌株 能在 70 ℃时适应较高的酸性环境. 2.4 浸出前后矿石表面形貌对比 图 5 为 C3 组生物浸出前后的黄铁矿颗粒表面 的扫描电镜图像对比图. 图 5(a) 表明，浸出前颗 粒表面相对致密，晶形规整；而图 5(b) 显示，浸 出后矿石晶形破坏、孔裂隙发育和扩展明显，并在 晶簇间形成大小不一的溶蚀坑，颗粒表面出现少量 疏松多孔的沉淀. 矿石表面形貌发生这些演化，是 因为随着浸出的进行，浸矿细菌不断附着在颗粒表 面，或沿矿物裂隙进入矿石内部，并通过直接作用 或间接作用机理与矿物发生反应，促进了黄铁矿的 溶解. 图 6 为不同初始 pH 值时浸出富液中 SO2− 4 及 TFe 浓度增加值及其拟合线，拟合线斜率即为 SO2− 4 及 TFe 浓度增加值之比. 四组中 SO2− 4 及 TFe 浓度 增加值之比分别为 2.85 (C1)、1.88 (C2)、1.54 (C3) 及 1.81 (C4). 黄铁矿通过硫代硫酸盐途径溶解，生成 的 S2O 2− 3 等中间产物在细菌催化下全部或部分氧 化成 SO2− 4 . FeS2 中元素摩尔比为 S:Fe=2:1，如果 黄铁矿溶解产物不发生二次反应，且中间产物全部 氧化成 SO2− 4 ，则浸出液中增加的离子浓度比理论 值也应为 SO2− 4 :Fe=2:1. 实验中四组 SO2− 4 与 TFe 增加的浓度比 SO2− 4 :TFe 的观测值与理想值的差值 亦可通过拟合直线的斜率表示，拟合直线斜率越接 近 2，表明理想值与观测值偏差越小，否则偏差较 大。通过图 6 可以看到，四组 SO2− 4 与 TFe 增加 的浓度比 SO2− 4 :TFe 的观测值的拟合直线的斜率 为 1.81∼2.85，说明其观测与理想值存在一定偏差， 具体原因可能为 Fe3+、SO2− 4 等离子都参与了沉淀 反应[14] . 用电子探针进一步分析颗粒表面沉淀，检 测出其主要成分为黄钾铁矾，此外还有少量的单质 硫

.854 北京科技大学 学报 第35卷 20 25 15 30 思 (a) 0 25 20 ▲Fe+ 浸出率 15 浸出率 20 15 5 10 5 5 ⊙ ● 0 ●● 0 5 10 152025 30 1015202530 浸出时间/d 浸出时间/d 40 25 6 35 (c) ▣(d) 20 ◇浸出率 ◇浸出率 0-⊙ 10 16 20 10 5 0 10152025 3 10152025 30 0 5 浸出时间/d 浸出时间/d 图4不同初始pH值下浸出时间对浸出富液中可溶性TFe浓度、Fe3+离子浓度、Fe+离子浓度及铁浸出率的影响.(a)C1,pH 1.0:(b)C2,pH1.5:(c)C3,pH2.0:(d)C4,pH2.5 Fig.4 Effects of leaching time on the soluble TFe,Fe3+ion,Fe2+ion concentrations and extraction rates in pregnant leaching solutions at variable initial pH values:(a)C1,pH 1.0;(b)C2.pH 1.5;(c)C3,pH 2.0;and (d)C4.pH 2.5 是品 高米品 图5极端嗜热硫杆菌柱浸实验28d前后黄铁矿表面形貌对比.(a)浸出前；(b)浸出后 Fig.5 Pyrite surface morphology before and after column bioleaching by extreme thermophilic Thiobacillus for 28 d:(a)before leaching;(b)after leaching 王长秋等)认为高硫酸铁浓度有利于形成黄钾铁 量密切相关.当初始pH值为1.0时，SO2及TFe 矾，且高温时Fe3+离子能在更低的pH环境中发生 浓度增加值之比大于2，表明s0、S20?-等中间产 沉淀：而Xia等用古生菌Acidianus manzaen.sis浸 物能全部氧化成SO子，甚至促进了Fe3+在矿石颗 出黄铁矿时，仍在T=65℃，pH0.85的环境中发现 粒表面的吸附：而当初始pH值≥1.5时，SO子及 黄钾铁矾沉淀门.本实验与上述研究结果一致，即 T℉e浓度增加值之比在1.54~1.88，表明硫代硫酸盐 在pH0.91的高酸、高温(70℃)和高铁(T℉e质 已基本上氧化成SO.尽管单质硫的化学惰性较 量浓度为38.9gL-1)环境中能促进黄钾铁矾的生 强，极端嗜热硫杆菌仍能在pH值<0.9时将其氧化， 成.图6也表明，初始pH值是SO及Fe3+离 显示出该菌株在高酸高温环境中生物脱硫应用上的 子参与沉淀反应的控制条件之一，且与其沉淀生成 潜力

· 854 · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 35 卷 图 4 不同初始 pH 值下浸出时间对浸出富液中可溶性 TFe 浓度、Fe3+ 离子浓度、Fe2+ 离子浓度及铁浸出率的影响. (a) C1，pH 1.0; (b) C2，pH 1.5; (c) C3，pH 2.0; (d) C4，pH 2.5 Fig.4 Effects of leaching time on the soluble TFe, Fe3+ ion, Fe2+ ion concentrations and extraction rates in pregnant leaching solutions at variable initial pH values: (a) C1, pH 1.0; (b) C2, pH 1.5; (c) C3, pH 2.0; and (d) C4, pH 2.5 图 5 极端嗜热硫杆菌柱浸实验 28 d 前后黄铁矿表面形貌对比. (a) 浸出前; (b) 浸出后 Fig.5 Pyrite surface morphology before and after column bioleaching by extreme thermophilic Thiobacillus for 28 d: (a) before leaching; (b) after leaching 王长秋等[15] 认为高硫酸铁浓度有利于形成黄钾铁 矾，且高温时 Fe3+ 离子能在更低的 pH 环境中发生 沉淀；而 Xia 等用古生菌 Acidianus manzaensis 浸 出黄铁矿时，仍在 T=65 ℃，pH 0.85 的环境中发现 黄钾铁矾沉淀[7] . 本实验与上述研究结果一致，即 在 pH 0.91 的高酸、高温 (70 ℃) 和高铁 (TFe 质 量浓度为 38.9 g·L −1 ) 环境中能促进黄钾铁矾的生 成. 图 6 也表明，初始 pH 值是 SO2− 4 及 Fe3+ 离 子参与沉淀反应的控制条件之一，且与其沉淀生成 量密切相关. 当初始 pH 值为 1.0 时，SO2− 4 及 TFe 浓度增加值之比大于 2，表明 S 0、S2O 2− 3 等中间产 物能全部氧化成 SO2− 4 ，甚至促进了 Fe3+ 在矿石颗 粒表面的吸附；而当初始 pH 值 >1.5 时，SO2− 4 及 TFe 浓度增加值之比在 1.54∼1.88，表明硫代硫酸盐 已基本上氧化成 SO2− 4 . 尽管单质硫的化学惰性较 强，极端嗜热硫杆菌仍能在 pH 值 <0.9 时将其氧化， 显示出该菌株在高酸高温环境中生物脱硫应用上的 潜力