前言 ·3· 贵的修改意见和建议。对于这些帮助，除了真诚的谢意，我们唯有希望：我们奉献的不只是 时间、精力和汗水！ 唐克轩 2005年6月 于复旦大学遗传学研究所
贵的修改意见和建议。对于这些帮助，除了真诚的谢意，我们唯有希望：我们奉献的不只是 时间、精力和汗水！ 唐克轩 2005 年 6 月 于复旦大学遗传学研究所 前 言 ·3·
目 录 第一章中草药生物技术概论… 第一节中草药生物技术的范畴 一、中草药概念的辨析…… 1 二、中草药生物技术的概念… 3 1.生物技术的概念及其发展 2.中草药生物技术的概念… 4 三、中草药生物技术的构成 1.细胞工程… 5 2.发酵工程… 3.酶工程… 6 4.基因工程… 6 5.分子标记技术… 6 第二节中草药生物技术的研究内容… 一、细胞工程的研究内容… 7 二、发酵工程的研究内容…… …8 三、酶工程的研究内容… 四、基因工程的研究内容… 9 五、分子标记技术的研究内容 10 第三节中草药生物技术的研究进展 11 一、我国药用植物资源的研究现状 11 二、我国药用植物资源开发利用的研究进展 12 1.通过植物次生代谢工程开发药物… 13 2.药用植物组织细胞培养取得进展…… 13 3.药用植物的发酵工程产品投入市场… 15 三、药用植物酶和蛋白质工程的研究亟待加强… 16 四、中草药基因工程研究的热，点和发展趋势… 16 1.转基因药用植物…… 16 2.次生代谢途径关键基因的克隆及代谢工程…… 16 3.药用植物分子标记育种… 17 第四节中草药生物技术的产业化与发展前景… 17 一、中草药生物技术的产业化研究概述 17 1.药用植物生物技术的产业化初具雏形… 17 2.医药生物技术产业化进展迅速……18
目 录 第一章 中草药生物技术概论!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 1 第一节 中草药生物技术的范畴!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 1 一、中草药概念的辨析 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 1 二、中草药生物技术的概念 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 3 1. 生物技术的概念及其发展 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 3 2. 中草药生物技术的概念 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 4 三、中草药生物技术的构成 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 5 1. 细胞工程 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 5 2. 发酵工程 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 5 3. 酶工程 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 6 4. 基因工程 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 6 5. 分子标记技术 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 6 第二节 中草药生物技术的研究内容!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 7 一、细胞工程的研究内容 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 7 二、发酵工程的研究内容 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 8 三、酶工程的研究内容 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 8 四、基因工程的研究内容 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 9 五、分子标记技术的研究内容 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 10 第三节 中草药生物技术的研究进展 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 11 一、我国药用植物资源的研究现状 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 11 二、我国药用植物资源开发利用的研究进展 !!!!!!!!!!!!!!!! 12 1. 通过植物次生代谢工程开发药物 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! 13 2. 药用植物组织细胞培养取得进展 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! 13 3. 药用植物的发酵工程产品投入市场 !!!!!!!!!!!!!!!!!! 15 三、药用植物酶和蛋白质工程的研究亟待加强 !!!!!!!!!!!!!!! 16 四、中草药基因工程研究的热点和发展趋势 !!!!!!!!!!!!!!!! 16 1. 转基因药用植物 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 16 2. 次生代谢途径关键基因的克隆及代谢工程 !!!!!!!!!!!!!!! 16 3. 药用植物分子标记育种 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 17 第四节 中草药生物技术的产业化与发展前景 !!!!!!!!!!!!!!!! 17 一、中草药生物技术的产业化研究概述 !!!!!!!!!!!!!!!!!! 17 1. 药用植物生物技术的产业化初具雏形 !!!!!!!!!!!!!!!!! 17 2. 医药生物技术产业化进展迅速 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 18
·2 中草药生物技术 3.我国医药生物技术及其产业发展面临的问题…19 二、中草药生物技术的发展前景… 21 1.应用生物技术开展药用植物资源研究及品种选育…21 2.利用植物细胞培养及转基因技术生产次生代谢产物…21 3.分子标记技术在药用植物研究上的应用前景…22 第二章中草药组织培养的基本技术…27 第一节药用植物组织培养技术… …27 一、药用植物组织培养的基本原理… 4…4……4……4小4… 27 1.植物细胞的全能性… 27 2.植物细胞全能性的实现… 28 二、药用植物组织培养的基本技术…… …29 1.植物组织培养的基本设施……… 29 2.常用工具和器皿的准备、清洗和灭菌… 32 3.培养基及其配制…… 33 4。外植体的制备… 38 5.接种与培养… ………40 6.定期检查和细胞学观察… 44 7.生根与移栽…… 44 第二节药用植物组织培养中存在的问题与对策… 47 一、污染的原因及对策… 47 1.真菌性污染及对策… 47 2.细菌性污染及对策… 48 3.常见污染方面的问题及对策… 49 二、褐变现象产生的机制及对策… 50 1.褐变现象产生的影响因素… 50 2.褐变的主要机制……… 51 3.克服褐变现象的对策… 52 三、玻璃化的原因及对策… 53 1.玻璃苗发生的影响因素 53 2.玻璃化主要机制……… 55 3.克服玻璃化现象的对策…… 56 第三章中草药原生质体培养与细胞杂交 60 第一节原生质体培养… 60 一、材料的选择与预处理 61 1.材料的选择… 61 2.材料的预处理… 62 二、原生质体分离与纯化 年4年0年4中年4000年卡？ 62 1.原生质体分离的基本技术… 62 2.原生质体纯化……… ………4…………+… 65
3. 我国医药生物技术及其产业发展面临的问题 !!!!!!!!!!!!!! 19 二、中草药生物技术的发展前景 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 21 1. 应用生物技术开展药用植物资源研究及品种选育 !!!!!!!!!!!! 21 2. 利用植物细胞培养及转基因技术生产次生代谢产物 !!!!!!!!!!! 21 3. 分子标记技术在药用植物研究上的应用前景 !!!!!!!!!!!!!! 22 第二章 中草药组织培养的基本技术 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 27 第一节 药用植物组织培养技术 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 27 一、药用植物组织培养的基本原理 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 27 1. 植物细胞的全能性 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 27 2. 植物细胞全能性的实现 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 28 二、药用植物组织培养的基本技术 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 29 1. 植物组织培养的基本设施 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 29 2. 常用工具和器皿的准备、清洗和灭菌 !!!!!!!!!!!!!!!!! 32 3. 培养基及其配制 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 33 4. 外植体的制备 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 38 5. 接种与培养 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 40 6. 定期检查和细胞学观察 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 44 7. 生根与移栽 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 44 第二节 药用植物组织培养中存在的问题与对策 !!!!!!!!!!!!!!! 47 一、污染的原因及对策 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 47 1. 真菌性污染及对策 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 47 2. 细菌性污染及对策 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 48 3. 常见污染方面的问题及对策 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 49 二、褐变现象产生的机制及对策 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 50 1. 褐变现象产生的影响因素 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 50 2. 褐变的主要机制 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 51 3. 克服褐变现象的对策 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 52 三、玻璃化的原因及对策 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 53 1. 玻璃苗发生的影响因素 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 53 2. 玻璃化主要机制 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 55 3. 克服玻璃化现象的对策 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 56 第三章 中草药原生质体培养与细胞杂交 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! 60 第一节 原生质体培养 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 60 一、材料的选择与预处理 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 61 1. 材料的选择 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 61 2. 材料的预处理 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 62 二、原生质体分离与纯化 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 62 1. 原生质体分离的基本技术 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 62 2. 原生质体纯化 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 65 ·2· 中草药生物技术
目 录 ·3 三、原生质体鉴定与活力测定 66 1.原生质体鉴定… 66 2.活力测定… 66 3.活力计算 67 四、原生质体培养与植株再生… 67 1。原生质体的培养基 67 2.原生质体培养条件… 69 3.原生质体培养方法… 00”4444+44400440 69 4.原生质体发育与植株再生程序… 71 五、提高原生质体培养质量的技术要点 72 1.选择适当的起始材料……… 72 2.材料预质壁分离… 72 3。培养基的组成… 72 4.选择适宜的培养方法…… 72 5.原生质体植板密度… 73 6.防止褐变… 73 六、药用植物原生质体培养… 73 1.药用植物原生质体培养现状… 74 2.几种重要药用植物的原生质体培养… 76 第二节细胞杂交… 80 一、诱导原生质体融合… 80 1.原生质体融合方法… 80 2.对称性融合与非对称性融合… 86 二、融合体的检测与筛选 87 三、杂种植株的鉴定 89 1.形态学鉴定… 89 2.细胞学鉴定… 89 3.同工酶谱分析… 89 4。分子生物学方法… 89 5.其他方法… 90 第三节杂种植株的遗传与育种应用… 90 一、植物体细胞杂交与遗传有种… 90 二、药用植物体细胞杂交在品种改良中的应用 91 三、药用植物体细胞杂交遗传育种应用举例… 92 1.原生质体对称性电融合实例… 93 2.“供体/受体”系统原生质体融合实例… 94 3.“配子体/体细胞”系统原生质体融合实例 96 第四章药用植物的细胞培养与发酵工程技术……102 第一节药用植物细胞培养的基本技术…………102
三、原生质体鉴定与活力测定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 66 1. 原生质体鉴定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 66 2. 活力测定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 66 3. 活力计算 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 67 四、原生质体培养与植株再生 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 67 1. 原生质体的培养基 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 67 2. 原生质体培养条件 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 69 3. 原生质体培养方法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 69 4. 原生质体发育与植株再生程序 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 71 五、提高原生质体培养质量的技术要点 !!!!!!!!!!!!!!!!!! 72 1. 选择适当的起始材料 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 72 2. 材料预质壁分离 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 72 3. 培养基的组成 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 72 4. 选择适宜的培养方法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 72 5. 原生质体植板密度 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 73 6. 防止褐变 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 73 六、药用植物原生质体培养 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 73 1. 药用植物原生质体培养现状 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 74 2. 几种重要药用植物的原生质体培养 !!!!!!!!!!!!!!!!!! 76 第二节 细胞杂交 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 80 一、诱导原生质体融合 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 80 1. 原生质体融合方法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 80 2. 对称性融合与非对称性融合 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 86 二、融合体的检测与筛选 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 87 三、杂种植株的鉴定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 89 1. 形态学鉴定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 89 2. 细胞学鉴定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 89 3. 同工酶谱分析 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 89 4. 分子生物学方法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 89 5. 其他方法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 90 第三节 杂种植株的遗传与育种应用 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 90 一、植物体细胞杂交与遗传育种 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 90 二、药用植物体细胞杂交在品种改良中的应用 !!!!!!!!!!!!!!! 91 三、药用植物体细胞杂交遗传育种应用举例 !!!!!!!!!!!!!!!! 92 1. 原生质体对称性电融合实例 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 93 2. “供体/受体”系统原生质体融合实例 !!!!!!!!!!!!!!!!! 94 3. “配子体/体细胞”系统原生质体融合实例 !!!!!!!!!!!!!!! 96 第四章 药用植物的细胞培养与发酵工程技术!!!!!!!!!!!!!!!!! 102 第一节 药用植物细胞培养的基本技术!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 102 目 录 ·3·
·4 中草药生物技术 一、药用植物细胞培养的主要材料和条件… 102 1.外植体和细胞培养材料的选择 102 2.培养基… 103 3.培养条件… 104 二、药用植物细胞悬浮培养系的建立和高产细胞株的筛选方法…105 1。愈伤组织诱导和继代培养… 106 2.液体悬浮培养的建立 106 3.用振荡法或酶法游离出单个细胞或小细胞团进行继代培养 107 4。高产细胞株的筛选…… 107 三、药用植物悬浮细胞的继代培养… 108 1.批量培养… 108 2.连续培养 109 四、药用植物悬浮细胞的同步培养… 109 1.体积选择法 4*4.4…4 110 2.冷处理方法 110 3.营养饥饿法… 110 4.生长素饥饿法 110 5.抑制和抑制解除法… 11 6.有丝分裂阻抑法 … 111 五、药用植物细胞悬浮培养过程中各种参数的测定… 111 1.细胞大小测定 111 2.细胞重量测定 112 3.细胞体积测定 112 4.有丝分裂指数测定 112 5.细胞起始密度测定 113 6.活细胞率测定… 114 第二节药用植物细胞的大量培养… 114 一、药用植物细胞大规模培养工艺与技术优化…… 116 1。药用植物细胞大规模培养工艺… 116 2.药用植物细胞大规模培养过程的优化… 121 3.药用植物细胞大规模培养过程中的几个问题 124 二、药用植物细胞大规模培养应用实例… 125 1.红豆杉细胞培养生产紫杉醇 125 2.人参细胞培养生产人参皂苷 126 3.长春花细胞培养生产生物碱 127 4.紫草细胞培养生产紫草宁及其衍生物 128 5.丹参细胞培养生产二萜醌类和酚酸类化合物 129 第三节药用真菌发酵工程的技术与应用… 131 一、药用真菌的基本生产技术………132
一、药用植物细胞培养的主要材料和条件 !!!!!!!!!!!!!!!!! 102 1. 外植体和细胞培养材料的选择 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! 102 2. 培养基 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 103 3. 培养条件 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 104 二、药用植物细胞悬浮培养系的建立和高产细胞株的筛选方法 !!!!!!!! 105 1. 愈伤组织诱导和继代培养 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 106 2. 液体悬浮培养的建立 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 106 3. 用振荡法或酶法游离出单个细胞或小细胞团进行继代培养 !!!!!!! 107 4. 高产细胞株的筛选 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 107 三、药用植物悬浮细胞的继代培养 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 108 1. 批量培养 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 108 2. 连续培养 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 109 四、药用植物悬浮细胞的同步培养 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 109 1. 体积选择法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 110 2. 冷处理方法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 110 3. 营养饥饿法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 110 4. 生长素饥饿法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 110 5. 抑制和抑制解除法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 111 6. 有丝分裂阻抑法 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 111 五、药用植物细胞悬浮培养过程中各种参数的测定 !!!!!!!!!!!!! 111 1. 细胞大小测定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 111 2. 细胞重量测定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 112 3. 细胞体积测定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 112 4. 有丝分裂指数测定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 112 5. 细胞起始密度测定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 113 6. 活细胞率测定 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 114 第二节 药用植物细胞的大量培养!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 114 一、药用植物细胞大规模培养工艺与技术优化 !!!!!!!!!!!!!!! 116 1. 药用植物细胞大规模培养工艺 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! 116 2. 药用植物细胞大规模培养过程的优化 !!!!!!!!!!!!!!!! 121 3. 药用植物细胞大规模培养过程中的几个问题 !!!!!!!!!!!!! 124 二、药用植物细胞大规模培养应用实例 !!!!!!!!!!!!!!!!!! 125 1. 红豆杉细胞培养生产紫杉醇 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 125 2. 人参细胞培养生产人参皂苷 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 126 3. 长春花细胞培养生产生物碱 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 127 4. 紫草细胞培养生产紫草宁及其衍生物 !!!!!!!!!!!!!!!! 128 5. 丹参细胞培养生产二萜醌类和酚酸类化合物 !!!!!!!!!!!!! 129 第三节 药用真菌发酵工程的技术与应用!!!!!!!!!!!!!!!!!! 131 一、药用真菌的基本生产技术 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 132 ·4· 中草药生物技术