第4章延伸阅读 延伸阅读4-1通气搅拌好气性发酵技术 一、通气搅拌好气性发酵技术起源 1893年植物学家M.Wehmer发现青霉菌可以将蔗糖转变为柠檬酸，之后J.A.Martin发 现发酵糖也能转变成柠檬酸，当时人们还不知道如何将这种超前的思想进行商业化生产柠檬 酸。直到1919年，辉瑞公司的食品化学家J.Currie在有16年实验室熟练经验的助手J.Kane 的帮助下，尝试在大型浅盘培养黑曲霉生产柠檬酸获得了一些成功。通过将大型浅盘切割成 小型浅盘培养霉菌，产量极速提高。这是因为在20世纪初，柠檬酸广泛用于食品和软饮料， 比如备受大家欢迎的可口可乐和百事可乐。当时美国是柠檬酸消费的最大市场，柠檬酸是通 过进口国外的柠檬直接发酵获得。但是第一次世界大战的爆发，切断了国外柠檬的进口，作 为当时食品化学品的小型供应商的辉瑞公司积极寻求降低或替代进口柠檬生产柠檬酸的方 法。 经过几年的不懈努力，辉瑞公司的J.Currie和J.Kane建立实验室黑曲霉发酵蔗糖生产 柠檬酸的工艺。由于黑曲霉的好氧菌的特性，公司采取浅盘发酵(surface fermentation)方 法限制了柠檬酸的产量。最终，】.Kane和公司生化专家A.Finlay采取向发酵醪鼓入气泡， 同时增加电动搅拌器进行机械搅拌的方式成功的解决了溶氧问题，标志着人类通气搅拌好气 性发酵技术的诞生。辉瑞将实验工厂的这种柠檬酸发酵工艺用于商业化大规模柠檬酸生产， 使得柠檬酸的成本由最初的每磅1.25美元将至不足0.2美元。这不仅成就了辉瑞柠檬酸生产 之王的地位，而且在1944年6月6日第二次世界大战中，供应给盟军士兵的青霉素有90% 都是辉瑞公司生产，使得辉瑞公司成为生化制药商业巨头。 二、通气搅拌好气性发酵设备分类 通气搅拌好气性发掘技术的核心就是将空气不断通入到发酵液中，供给微生物所需的氧 气，气泡越小，气液接触面积越大，氧气的溶解速率也越快，氧气的利用率也越搞，产品的 产率也就越大。随着机械加工技术和流体力学的不断发展，通气搅拌好气性发酵技术获得了 长足的发展，主要通过发酵罐设备构造的不同实现通气搅拌好气性发酵，当前主要的设备分 为以下几类： (一)机械搅拌发酵罐 机械搅拌发酵罐是发酵工厂常用类型之一，适用于多种生物制品的生产，它是利用机械 搅拌器的作用，将空气和发酵醪重发混合促使氧气在醪液中溶解，以供给微生物生长繁殖
第 4 章延伸阅读 延伸阅读 4-1 通气搅拌好气性发酵技术 一、通气搅拌好气性发酵技术起源 1893 年植物学家 M. Wehmer 发现青霉菌可以将蔗糖转变为柠檬酸，之后 J.A. Martin 发 现发酵糖也能转变成柠檬酸，当时人们还不知道如何将这种超前的思想进行商业化生产柠檬 酸。直到 1919 年，辉瑞公司的食品化学家 J. Currie 在有 16 年实验室熟练经验的助手 J. Kane 的帮助下，尝试在大型浅盘培养黑曲霉生产柠檬酸获得了一些成功。通过将大型浅盘切割成 小型浅盘培养霉菌，产量极速提高。这是因为在 20 世纪初，柠檬酸广泛用于食品和软饮料， 比如备受大家欢迎的可口可乐和百事可乐。当时美国是柠檬酸消费的最大市场，柠檬酸是通 过进口国外的柠檬直接发酵获得。但是第一次世界大战的爆发，切断了国外柠檬的进口，作 为当时食品化学品的小型供应商的辉瑞公司积极寻求降低或替代进口柠檬生产柠檬酸的方 法。 经过几年的不懈努力，辉瑞公司的 J. Currie 和 J. Kane 建立实验室黑曲霉发酵蔗糖生产 柠檬酸的工艺。由于黑曲霉的好氧菌的特性，公司采取浅盘发酵（surface fermentation）方 法限制了柠檬酸的产量。最终，J. Kane 和公司生化专家 A. Finlay 采取向发酵醪鼓入气泡， 同时增加电动搅拌器进行机械搅拌的方式成功的解决了溶氧问题，标志着人类通气搅拌好气 性发酵技术的诞生。辉瑞将实验工厂的这种柠檬酸发酵工艺用于商业化大规模柠檬酸生产， 使得柠檬酸的成本由最初的每磅 1.25 美元将至不足 0.2 美元。这不仅成就了辉瑞柠檬酸生产 之王的地位，而且在 1944 年 6 月 6 日第二次世界大战中，供应给盟军士兵的青霉素有 90% 都是辉瑞公司生产，使得辉瑞公司成为生化制药商业巨头。 二、通气搅拌好气性发酵设备分类 通气搅拌好气性发掘技术的核心就是将空气不断通入到发酵液中，供给微生物所需的氧 气，气泡越小，气液接触面积越大，氧气的溶解速率也越快，氧气的利用率也越搞，产品的 产率也就越大。随着机械加工技术和流体力学的不断发展，通气搅拌好气性发酵技术获得了 长足的发展，主要通过发酵罐设备构造的不同实现通气搅拌好气性发酵，当前主要的设备分 为以下几类： （一）机械搅拌发酵罐 机械搅拌发酵罐是发酵工厂常用类型之一，适用于多种生物制品的生产，它是利用机械 搅拌器的作用，将空气和发酵醪重发混合促使氧气在醪液中溶解，以供给微生物生长繁殖
生产生物产品所需的氧气。 (二)射流式好氧发酵罐 与常规的机械搅拌发酵罐不同之处在于，这种发酵罐利用射流混合搅拌装置替代机械搅 拌装置，充分利用压缩空气能量，进行气-液射流混合搅拌，提高溶氧系数，降低能耗，简 化设备，提高单位产量。比如伍氏发酵罐。 (三)气升式发酵罐 气升式发酵罐是通过压缩空气进入空气分布器进入液体后，形成的气泡通过液体的剧烈 翻动而分散均匀，使液体在内部形成定向循环流动，从而提供微生物生长繁殖和生产发酵产 品所需的氧气，具有较高的溶氧系数和溶氧效率以及剪切力小，对生物细胞损伤小的特点， 已经广泛用于生物废料处理。 (四)自吸式发酵罐 自吸式发酵罐不需要空气压缩机提供压缩空气，依靠特设的机械搅拌吸气装置或液体喷 射吸气装置吸入无菌空气并同时实现混合搅拌与溶氧传质的发酵罐，主要用于生产单细胞蛋 白，酵母，醋酸发酵和维生素生产。 三、好气性发酵技术的应用进展 传统的射流式好氧发酵罐和气升式发酵罐都需要一个供给压缩空气的设备，导致动力消 耗较大，在空气净化过程需要复杂的去除压缩空气中夹带的水雾和油雾的空气净化系统。机 械搅拌发酵罐传热传质性能较好，固体颗粒悬浮性好，但考虑到其气体利用能力不足，需要 增加气体压缩机对未反应的循环气体进行处理，增加了操作成本。然而，自吸式发酵罐因其 相比于上述的传统发酵罐的在溶氧、节能、传质方面的显著优势正受到越来越多发酵相关企 业的重视，国内发酵行业各个生产企业也在用自吸式发酵罐逐步代替传统发酵罐，随着装置 和材料的不断改进，自吸式发酵罐必将向高产、高效、低能耗的方向发展
生产生物产品所需的氧气。 （二）射流式好氧发酵罐 与常规的机械搅拌发酵罐不同之处在于，这种发酵罐利用射流混合搅拌装置替代机械搅 拌装置，充分利用压缩空气能量，进行气-液射流混合搅拌，提高溶氧系数，降低能耗，简 化设备，提高单位产量。比如伍氏发酵罐。 （三）气升式发酵罐 气升式发酵罐是通过压缩空气进入空气分布器进入液体后，形成的气泡通过液体的剧烈 翻动而分散均匀，使液体在内部形成定向循环流动，从而提供微生物生长繁殖和生产发酵产 品所需的氧气，具有较高的溶氧系数和溶氧效率以及剪切力小，对生物细胞损伤小的特点， 已经广泛用于生物废料处理。 （四）自吸式发酵罐 自吸式发酵罐不需要空气压缩机提供压缩空气，依靠特设的机械搅拌吸气装置或液体喷 射吸气装置吸入无菌空气并同时实现混合搅拌与溶氧传质的发酵罐，主要用于生产单细胞蛋 白，酵母，醋酸发酵和维生素生产。 三、好气性发酵技术的应用进展 传统的射流式好氧发酵罐和气升式发酵罐都需要一个供给压缩空气的设备，导致动力消 耗较大，在空气净化过程需要复杂的去除压缩空气中夹带的水雾和油雾的空气净化系统。机 械搅拌发酵罐传热传质性能较好，固体颗粒悬浮性好，但考虑到其气体利用能力不足，需要 增加气体压缩机对未反应的循环气体进行处理，增加了操作成本。然而，自吸式发酵罐因其 相比于上述的传统发酵罐的在溶氧、节能、传质方面的显著优势正受到越来越多发酵相关企 业的重视，国内发酵行业各个生产企业也在用自吸式发酵罐逐步代替传统发酵罐，随着装置 和材料的不断改进，自吸式发酵罐必将向高产、高效、低能耗的方向发展
延伸阅读4-2徽生物工程菌株的构建 一、微生物工程菌株概念 微生物工程菌株是指在基因水平上，人为将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来， 在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一微生物（宿主）细胞， 使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达，从而具有新的遗传特性的微生物菌株。 二、徽生物工程菌株构建的流程 微生物工程菌株主要用生产酶制剂、蛋白药物、疫苗以及其他生物制品。构建微生物工 程菌株的基本流程如下：①目的基因的获得目的基因是指微生物工程菌株需要表达的产物的 基因，可以通过化学合成、生物组织中基因组的提取和PCR等扩增。②目的基因和载体的 酶切通过限制性内切酶将目的基因和载体进行酶切，获得可以彼此连接的两个片段。③重组 载体的构建上述两个片段通过DNA连接酶进行连接并转化到大肠杆菌进行增殖获得重组载 体.④重组载体的转化将重组载体通过适宜的转化方式转化到感受态宿主细胞中，进行培养。 目前常用的宿主菌有大肠杆菌、毕赤酵母、藻类和枯草芽孢杆菌等。⑤微生物工程菌株的筛 选与鉴定通过载体遗传标记基因、报告基因或者目的基因进行菌落PC筛选，筛选出的阳 性菌株进而进行表达产物的鉴定（图S4-1)。 PCR扩增 双酶切 感受态大肠杆菌 目的基因来源 目的基因 双酶切 -2-=73 转化以及筛选 -989o8 DNA连接酶 00 载体 重组载体 大肠杆菌工程菌 图S4-1微生物工程菌株构建策略 三、徽生物工程菌株的应用 微生物工程菌株己经广泛的用于各种生物酶制剂、重组疫苗、基因药物的生产和改善食 品风味与品质，随着生物技术的不断深入发展，微生物工程菌的重要作用会不断地被发掘和 利用
延伸阅读 4-2 微生物工程菌株的构建 一、微生物工程菌株概念 微生物工程菌株是指在基因水平上，人为将所需的某一供体生物的遗传物质提取出来， 在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，与载体连接，然后导入另一微生物（宿主）细胞， 使外源遗传物质在其中进行正常复制和表达，从而具有新的遗传特性的微生物菌株。 二、微生物工程菌株构建的流程 微生物工程菌株主要用生产酶制剂、蛋白药物、疫苗以及其他生物制品。构建微生物工 程菌株的基本流程如下：①目的基因的获得目的基因是指微生物工程菌株需要表达的产物的 基因，可以通过化学合成、生物组织中基因组的提取和 PCR 等扩增。②目的基因和载体的 酶切通过限制性内切酶将目的基因和载体进行酶切，获得可以彼此连接的两个片段。③重组 载体的构建上述两个片段通过 DNA 连接酶进行连接并转化到大肠杆菌进行增殖获得重组载 体。④重组载体的转化将重组载体通过适宜的转化方式转化到感受态宿主细胞中，进行培养。 目前常用的宿主菌有大肠杆菌、毕赤酵母、藻类和枯草芽孢杆菌等。⑤微生物工程菌株的筛 选与鉴定通过载体遗传标记基因、报告基因或者目的基因进行菌落 PCR 筛选，筛选出的阳 性菌株进而进行表达产物的鉴定（图 S4-1）。 图 S4-1 微生物工程菌株构建策略 三、微生物工程菌株的应用 微生物工程菌株已经广泛的用于各种生物酶制剂、重组疫苗、基因药物的生产和改善食 品风味与品质，随着生物技术的不断深入发展，微生物工程菌的重要作用会不断地被发掘和 利用
延伸阅读4-3植物乳杆菌优良菌株自然选育 泡菜是中国传统的一种发酵蔬菜制品泡菜，不仅味美、爽口、开胃，而且具有调节肠道 菌群平衡，降低胆固醇等功能。泡菜是指在低浓度食盐的高渗透压环境下，乳酸菌发酵可发 酵糖产生大量乳酸，抑制其他微生物生长的一种具有酸味的发酵食品，其品质的好坏和产品 质量的均一取决于其中的植物乳杆菌的菌种特性。 通过泡菜中植物乳杆菌的自然选育可以获得发酵性能优越的植物乳杆菌优良菌种，其选 育的基本流程为如图S4-2,其过程简单描述如下： ①乳酸菌分离：取泡菜汁进行10倍系列梯度进行稀释，吸取105、106和107稀释度的 泡菜汁各1mL涂布于MRS培养基（乳酸细菌培养基）平板中，放置在33℃培养箱中培养 24~36h,挑取使培养基变黄的单菌落，于MRS平板上划线分离纯化，经革兰氏染色和接 触酶反应，挑出革兰氏阳性、接触酶阴性菌株斜面保存。 ②液体培养：挑取上述MRS平板上单菌落接入到含有3 mL MRS液体培养基的试管中， 33℃静止培养36h,以3%的接种量转接到装50mL液体培养基的250mL摇瓶，33℃静 止培养36h。 ③菌种筛选：将分离到的菌株液体培养后，按5%的接种量接种到甘蓝盐水(6%以下) 中进行室温(20℃)发酵72小时，挑选出产酸速度快、发酵风味好的菌株保藏。 ④菌株鉴定：按照细菌鉴定的16SDNA的鉴定方法对产酸速度快的菌种进行鉴定，获得 产酸性能优良的植物乳杆菌。 101 109 泡莱汁梯度稀 选取单菌落划线 取稀液培养 纯化蹄选 侧定酸合量及评 将菌液按种到甘蓝 价发薛效果 叶片盐水中发醉 图S4-2植物乳杆菌优良菌株自然选育流程
延伸阅读 4-3 植物乳杆菌优良菌株自然选育 泡菜是中国传统的一种发酵蔬菜制品泡菜，不仅味美、爽口、开胃，而且具有调节肠道 菌群平衡，降低胆固醇等功能。泡菜是指在低浓度食盐的高渗透压环境下，乳酸菌发酵可发 酵糖产生大量乳酸，抑制其他微生物生长的一种具有酸味的发酵食品，其品质的好坏和产品 质量的均一取决于其中的植物乳杆菌的菌种特性。 通过泡菜中植物乳杆菌的自然选育可以获得发酵性能优越的植物乳杆菌优良菌种，其选 育的基本流程为如图 S4-2，其过程简单描述如下： ①乳酸菌分离：取泡菜汁进行 10 倍系列梯度进行稀释，吸取 10 -5、10 -6和 10 -7 稀释度的 泡菜汁各 1 mL 涂布于 MRS 培养基（乳酸细菌培养基）平板中，放置在 33 ℃培养箱中培养 24～36 h，挑取使培养基变黄的单菌落，于 MRS 平板上划线分离纯化，经革兰氏染色和接 触酶反应，挑出革兰氏阳性、接触酶阴性菌株斜面保存。 ②液体培养：挑取上述 MRS 平板上单菌落接入到含有 3 mL MRS 液体培养基的试管中， 33 ℃静止培养 36 h，以 3%的接种量转接到装 50 mL 液体培养基的 250 mL 摇瓶，33 ℃静 止培养 36 h。 ③菌种筛选：将分离到的菌株液体培养后，按 5% 的接种量接种到甘蓝盐水（6%以下） 中进行室温（20℃）发酵 72 小时，挑选出产酸速度快、发酵风味好的菌株保藏。 ④菌株鉴定：按照细菌鉴定的 16S DNA 的鉴定方法对产酸速度快的菌种进行鉴定，获得 产酸性能优良的植物乳杆菌。 图 S4-2 植物乳杆菌优良菌株自然选育流程
由于在该植物乳杆菌的筛选过程中，并未对该菌种进行任何人工的诱变处理，获得的植 物乳杆菌是在泡菜这种原有环境中的通过筛选自发诱变产乳酸能力更强的微生物菌株，因而 是属于自然选育。 自然选育这种微生物育种的方式效率比较低，目前己经很少使用，人工诱变和基因工程 菌的方式己经成为微生物育种的主要方式
由于在该植物乳杆菌的筛选过程中，并未对该菌种进行任何人工的诱变处理，获得的植 物乳杆菌是在泡菜这种原有环境中的通过筛选自发诱变产乳酸能力更强的微生物菌株，因而 是属于自然选育。 自然选育这种微生物育种的方式效率比较低，目前已经很少使用，人工诱变和基因工程 菌的方式已经成为微生物育种的主要方式