第10章延伸阅读 延伸阅读10-1标准的徽生物检测程序 一、微生物检测的基本理论与方法 微生物检测就是应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和微生物的种类、数量、性 质、活动规律及其对人和动物健康的影响。它与食品微生物学、医学微生物学、兽医微生物 学、农业微生物学、卫生学等关系甚为密切，与传染病学、免疫学、病理学、组织学、解剖 学等也有一定的联系。 微生物检测检验的常用方法有：微生物形态检查、生化试验、噬菌体分型、血清学分型、 毒性试验以及血清试管凝聚试验等。形态检查是通过菌落形态或借助染色和显微镜结构特征 不同的细菌鉴定区分的方法。理化方法是指用化学反应来测定微生物的代谢产物（微生物分 类鉴定中的重要依据)，常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区别的微生物。血清学反应， 即用相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。应用此 试验对待测微生物做血清分型检验。在微生物检验中，常用血清分型来鉴定分离到的细菌， 以最终确认检测结果。常用的试验操作有：糖酵解试验、淀粉水解试验、VP试验、甲基红 试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验、明胶试验、尿素酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验、 三糖帖试验等。这些生化试验检测方法的准确性、灵敏性较高，但涉及的试验较多，操作繁 琐，需要时间较长，而且要有大量人员参与。 二、微生物检测的标准程序 标准的微生物检测程序一般包括采样、增菌与分离培养、形态观察、菌落总数检测、生 化试验、血清学鉴定以及报告等步骤（图S10-1)
第 10 章延伸阅读 延伸阅读 10-1 标准的微生物检测程序 一、微生物检测的基本理论与方法 微生物检测就是应用微生物学的理论与方法，研究外界环境和微生物的种类、数量、性 质、活动规律及其对人和动物健康的影响。它与食品微生物学、医学微生物学、兽医微生物 学、农业微生物学、卫生学等关系甚为密切，与传染病学、免疫学、病理学、组织学、解剖 学等也有一定的联系。 微生物检测检验的常用方法有：微生物形态检查、生化试验、噬菌体分型、血清学分型、 毒性试验以及血清试管凝聚试验等。形态检查是通过菌落形态或借助染色和显微镜结构特征 不同的细菌鉴定区分的方法。理化方法是指用化学反应来测定微生物的代谢产物（微生物分 类鉴定中的重要依据），常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区别的微生物。血清学反应， 即用相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。应用此 试验对待测微生物做血清分型检验。在微生物检验中，常用血清分型来鉴定分离到的细菌， 以最终确认检测结果。常用的试验操作有：糖酵解试验、淀粉水解试验、V-P 试验、甲基红 试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验、明胶试验、尿素酶试验、氧化酶试验、硫化氢试验、 三糖帖试验等。这些生化试验检测方法的准确性、灵敏性较高，但涉及的试验较多，操作繁 琐，需要时间较长，而且要有大量人员参与。 二、微生物检测的标准程序 标准的微生物检测程序一般包括采样、增菌与分离培养、形态观察、菌落总数检测、生 化试验、血清学鉴定以及报告等步骤（图 S10-1）
采集处理后的样品 样品稀释 增殖培养 1:10稀释 1:100稀释 1:1000稀释 8 平板涂布 分离培养 未知菌落 生化试验鉴定 闲落总数计数 血清分型 报告 图S10-1标准微生物检测程序 采样原则是能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进 行取样。其中，如果是液体样品，要在充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注 射器抽取，注入无菌盛样容器。增菌培养一般用非选择性增菌培养基（如营养肉汤）来保证 大多数微生物的生长。分离培养根据待测微生物的特性选择相应的培养基，如金黄色葡萄球 菌可选择BPA(肉汁胨培养基)培养基、溶血性链球菌可选用血液琼脂基础培养基 (blood-.agar-base-medium、大肠菌群可选用伊红美兰培养基、军团菌可选用GVPC培养基以
图 S10-1 标准微生物检测程序 采样原则是能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进 行取样。其中，如果是液体样品，要在充分混匀后，无菌操作打开包装，用 100 mL 无菌注 射器抽取，注入无菌盛样容器。增菌培养一般用非选择性增菌培养基（如营养肉汤）来保证 大多数微生物的生长。分离培养根据待测微生物的特性选择相应的培养基，如金黄色葡萄球 菌可选择 BPA（肉汁胨培养基）培养基、溶血性链球菌可选用血液琼脂基础培养基 (blood-agar-base-medium)、大肠菌群可选用伊红美兰培养基、军团菌可选用 GVPC 培养基以
及BCYE培养基进行培养。培养后对长出的菌落或菌群进行形态观察。菌落计数先用肉眼 观察，点数菌落数，然后再用放大5~10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数 后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓 延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的50%，而其余50%中菌落数分布又 很均匀，则可将此50%平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。点计菌落数后，计算各稀 释级供试品溶液的平均菌落数，按菌数报告规定报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均 数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差一倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计 数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌、酵母菌计数。细菌培养3天，霉菌、酵母培养5天，逐 日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报 告。对待测微生物进行生化试验时，根据各生化鉴定系统要求对未知菌作常规处理，分别接 种不同生化鉴定系统培养基，观察结果。微量生物化学反应系统通常由10~24项生化指标 组合而成，通过对结果的判断，得出了3~7位数据，查阅编码手册得出相应的细菌名称， 与计算机联合使用，则会跟迅速、简便、快捷。根据鉴定细菌的不同功能，微量生化反应系 统常用者分为以下几种：(1)鉴定肠杆菌科用的微量生化反应系统：(2)鉴定非发酵菌用的 微量生化反应系统：(3)鉴定葡萄球菌用的微量生化反应系统。血清学试验对于鉴定一个微 生物的群、型来说至关重要，然而鉴定结果的准确、可靠与否又与生产厂家提供的诊断用品 质量、效价、特异性、敏感性、有效期等有密切的关系。通过以上试验鉴定步骤，可对待测 未知微生物做出可靠的鉴定
及 BCYE 培养基进行培养。培养后对长出的菌落或菌群进行形态观察。菌落计数先用肉眼 观察，点数菌落数，然后再用放大 5～10 倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数 后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓 延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的 50%，而其余 50%中菌落数分布又 很均匀，则可将此 50%平皿菌落计数后乘 2，以代表全皿菌落数。点计菌落数后，计算各稀 释级供试品溶液的平均菌落数，按菌数报告规定报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均 数不小于 15，则两个平板的菌落数不能相差一倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计 数，玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌、酵母菌计数。细菌培养 3 天，霉菌、酵母培养 5 天，逐 日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至 7 天进行菌落计数并报 告。对待测微生物进行生化试验时，根据各生化鉴定系统要求对未知菌作常规处理，分别接 种不同生化鉴定系统培养基，观察结果。微量生物化学反应系统通常由 10～24 项生化指标 组合而成，通过对结果的判断，得出了 3～7 位数据，查阅编码手册得出相应的细菌名称， 与计算机联合使用，则会跟迅速、简便、快捷。根据鉴定细菌的不同功能，微量生化反应系 统常用者分为以下几种：（1）鉴定肠杆菌科用的微量生化反应系统；（2）鉴定非发酵菌用的 微量生化反应系统；（3）鉴定葡萄球菌用的微量生化反应系统。血清学试验对于鉴定一个微 生物的群、型来说至关重要，然而鉴定结果的准确、可靠与否又与生产厂家提供的诊断用品 质量、效价、特异性、敏感性、有效期等有密切的关系。通过以上试验鉴定步骤，可对待测 未知微生物做出可靠的鉴定
延伸阅读10-2酶免疫测定法ELISA的种类 一、ELISA的原理 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的 抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活 性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记 的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量 呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检 物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间 接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。但是，ELISA技术只能检测 到g水平，精密度差（批内CV15%~20%),线性范围窄（一个数量级），存在HD-HOOK” 效应。 二、ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： 固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"(immunosorbent):酶标记的抗原或抗体，称为" 结合物”(conjugate):酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件， 可设计出各种不类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型： 1.双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下（图S10-2): ①将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 ②加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。 洗涤除去其他未结合物质。 ③加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合 的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 ④加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBAg、AFP、 hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建 立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应 用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备
延伸阅读 10-2 酶免疫测定法 ELISA 的种类 一、ELISA 的原理 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的 抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活 性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记 的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量 呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检 物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间 接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。但是，ELISA 技术只能检测 到 ng 水平，精密度差（批内 CV 15%～20%），线性范围窄（一个数量级），存在“HD-HOOK” 效应。 二、ELISA 的类型 ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： 固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；酶标记的抗原或抗体，称为" 结合物"（conjugate）；酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件， 可设计出各种不类型的检测方法。用于临床检验的 ELISA 主要有以下几种类型： 1. 双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下（图 S10-2）： ①将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 ②加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。 洗涤除去其他未结合物质。 ③加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合 的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 ④加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、 hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建 立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应 用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备
酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温 反应，作一步检测。 0 ,00 孵育 孵育 洗涤 洗涤 洗涤 包被特异性抗体 加含有抗原 加标记 加底物显色 的待测样品 特异性抗体 图S10-2双抗体夹心法原理 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗 体结合，而不再形成"夹心复合物“。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显 色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值 相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应(hook effect), 因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结 果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP 和尿液hCG等)时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可 削弱钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可 用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型 问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应 性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(rheumatoid factor,RF)的千扰。RF 是一种自身抗体，多为lgM型，能和多种动物IgG的F℃段结合。用作双抗体夹心法检测的 血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳 性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的 干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分 子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结 合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法 中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗
酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温 反应，作一步检测。 图 S10-2 双抗体夹心法原理 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗 体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显 色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值 相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect）， 因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结 果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中 HBsAg、AFP 和尿液 hCG 等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可 削弱钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的 a 决定簇，也可 用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在 HBsAg 的检测中应注意亚型 问题，HBsAg 有 adr、adw、ayr、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应 性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（rheumatoid factor，RF）的干扰。RF 是一种自身抗体，多为 IgM 型，能和多种动物 IgG 的 Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的 血清标本中如含有 RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳 性反应。采用 F（ab'）或 Fab 片段作酶结合物的试剂，由于去除了 Fc 段，从而消除 RF 的 干扰。双抗体夹心法 ELISA 试剂是否受 RF 的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分 子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结 合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法 中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗