实验八昆虫乙酰胆碱酯酶活性的测定一、实验目的：1.掌握吸光值的测定方法。2.掌握昆虫乙酰胆碱酯酶活性测定的方法、原理。二、实验材料1.供试昆虫：桃蚜（或其他昆虫）2.供试药剂：碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholineiodide，ATCh），5,5"-二硫双硝基苯甲酸（5,5"-dithio-bis-2-nitrobenzoicacid,DTNB），TritonX-100，牛血清白蛋白（BSA）、考马斯亮蓝G-250。3.仪器：分光光度计三、实验方法1.酶液制备：取成桃蚜（或其他昆虫）若干，用适量预冷的0.02mol/L，pH7.0（含0.1%TritonX-100）的磷酸盐缓冲液匀浆。4℃，10000×g离心15min，取上清液为酶源。2.乙酰胆碱酯酶比活力的测定取待测酶液0.25μL与0.25μLATCh混匀，30℃反应15min后加入0.9mL显色剂（DTNB）并中止反应，在412nm测定光密度(OD)值。AChE催化ATCh水解产生硫代胆碱和乙酸。硫代胆碱与DTNB结合生成黄色的5-硫-2-硝基苯甲酸盐离子，此物质在412nm处有最大吸收峰。按AChE的比活力（μmolminmg）=(△OD/mgxV)/exL，计算棉蚜AChE的比活力值。其中：△OD=OD/反应时间（单位为min）：V为反应总体积（单位为mL）：ε为产物与DTNB络合物的摩尔消光系数=13600L/mol/cm；L为比色杯的光程=1cm。四、作业1.思考用分光光度法测定乙酰胆碱酯酶比活力的原理。2.按实验方法和步骤测定实验给定昆虫的乙酰胆碱酯酶比活力值。14
14 实验八 昆虫乙酰胆碱酯酶活性的测定 一、实验目的： 1.掌握吸光值的测定方法。 2.掌握昆虫乙酰胆碱酯酶活性测定的方法、原理。 二、实验材料 1.供试昆虫：桃蚜（或其他昆虫） 2.供试药剂：碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide, ATCh），5,5’-二硫双硝基苯甲酸 （5,5’-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, DTNB），Triton X-100，牛血清白蛋白 (BSA)、考马斯亮 蓝 G-250。 3.仪器：分光光度计 三、实验方法 1.酶液制备： 取成桃蚜（或其他昆虫）若干，用适量预冷的 0.02mol/L，pH7.0（含 0.1% Triton X- 100） 的磷酸盐缓冲液匀浆。4℃，10000×g 离心 15min，取上清液为酶源。 2.乙酰胆碱酯酶比活力的测定 取待测酶液 0.25 μL 与 0.25 μL ATCh 混匀，30 ℃ 反应 15min 后加入 0.9 mL 显色剂 （DTNB）并中止反应，在 412 nm 测定光密度(OD)值。AChE 催化 ATCh 水解产生硫代胆 碱和乙酸。硫代胆碱与 DTNB 结合生成黄色的 5-硫-2-硝基苯甲酸盐离子，此物质在 412 nm 处有最大吸收峰。 按 AChE 的比活力（μmol·min-1 ·mg -1）＝(∆OD/mg×V) /ε×L, 计算棉蚜 AChE 的比活力值。 其中：∆OD=OD/反应时间（单位为 min）；V 为反应总体积（单位为 mL）；ε 为产物与 DTNB 络合物的摩尔消光系数＝13600 L/mol/cm；L 为比色杯的光程=1 cm。 四、作业 1.思考用分光光度法测定乙酰胆碱酯酶比活力的原理。 2.按实验方法和步骤测定实验给定昆虫的乙酰胆碱酯酶比活力值
实验九杀虫剂胃毒毒力测定测定杀虫剂的胃毒力，原则上应该使药剂通过口器进入消化道而发生致毒作用，尽量防止药剂与口器以外的其它部分直接接触。使昆虫在取食正常食物的同时将毒剂摄入消化道经肠壁细胞吸收进入血液，随血液循环到达作用部位而使昆虫中毒。常用的测定胃毒毒力的方法，通常有：毒饵法、叶片夹毒法和微量注射法，本实验采用叶片夹毒法。一、实验目的学习和掌握胃毒作用的测定方法一一叶片夹毒法，了解致死中量（LDso）的意义和测定技术。以便了解某种药剂是否具有从口腔进入并经中肠吸收到靶器官的毒性程度。二、实验材料和用具1.供试虫：菜青虫4龄幼虫40-50头2.供试药剂：50%辛硫磷EC3.供试用具：培养皿（直径8cm），打孔器（直径6cm），分析天平，纱布，镊子，试管，微量点滴器（1uL），试剂瓶（可用小青霉素瓶代替）4.供试材料：甘蓝叶片、新鲜面粉浆糊三、实验方法及步骤1、试虫与夹毒叶片的准备：（1）在田间采集龄期一致的菜青虫40头，分放在试管中，一管一头，并饥饿6小时后再进行试验，这样昆虫易于取食。(2）用打孔器钻取大小一致的圆叶片，立即用纱布覆盖，防止水分蒸发，或在培养皿中保湿，以免叶片收缩。(3）将50%辛硫磷EC用丙酮稀释成5个梯度浓度，每浓度2mL装入试剂瓶中备用。（4）用微量点滴器从低浓度开始，在一片圆叶上点滴1uL辛硫磷丙酮稀释液，待丙酮挥发后，和另一片涂有一薄层面粉浆糊的圆叶对贴，贴上后不要再挪动叶片，每浓度8张夹毒叶，共40张。以点滴1uL丙酮再与涂有浆糊的圆叶对贴的叶片做对照。2、饲喂幼虫：每个培养血放入一片夹毒叶，用湿棉花团置于皿中保湿，每个培养皿放进一头已称好重量的幼虫，让其取食。所有培养皿按顺序编号，记录虫的体重，2小时后检查取食情况。凡是吃完夹毒叶的投放清洁的无毒甘蓝叶继续饲喂，凡是未吃完夹毒叶的，则弃去此虫，不计入试验虫中，置于25℃恒温箱内保持24小时后检查试虫生存或死亡情况并记录。15
15 实验九 杀虫剂胃毒毒力测定 测定杀虫剂的胃毒力，原则上应该使药剂通过口器进入消化道而发生致毒作用，尽量防 止药剂与口器以外的其它部分直接接触。使昆虫在取食正常食物的同时将毒剂摄入消化道， 经肠壁细胞吸收进入血液，随血液循环到达作用部位而使昆虫中毒。常用的测定胃毒毒力的 方法，通常有：毒饵法、叶片夹毒法和微量注射法，本实验采用叶片夹毒法。 一、实验目的 学习和掌握胃毒作用的测定方法——叶片夹毒法，了解致死中量（LD50）的意义和测定 技术。以便了解某种药剂是否具有从口腔进入并经中肠吸收到靶器官的毒性程度。 二、实验材料和用具 ⒈ 供试虫：菜青虫4龄幼虫40-50头 ⒉ 供试药剂：50%辛硫磷EC ⒊ 供试用具：培养皿（直径8cm）,打孔器（直径6cm），分析天平，纱布，镊子，试管， 微量点滴器（1uL），试剂瓶（可用小青霉素瓶代替） ⒋ 供试材料：甘蓝叶片、新鲜面粉浆糊 三、实验方法及步骤 1、试虫与夹毒叶片的准备： ⑴ 在田间采集龄期一致的菜青虫40头，分放在试管中，一管一头，并饥饿6小时后再进行 试验，这样昆虫易于取食。 ⑵ 用打孔器钻取大小一致的圆叶片，立即用纱布覆盖，防止水分蒸发，或在培养皿中保湿， 以免叶片收缩。 ⑶ 将 50%辛硫磷 EC 用丙酮稀释成 5 个梯度浓度，每浓度 2mL 装入试剂瓶中备用。 ⑷ 用微量点滴器从低浓度开始，在一片圆叶上点滴 1uL 辛硫磷丙酮稀释液，待丙酮挥发后， 和另一片涂有一薄层面粉浆糊的圆叶对贴，贴上后不要再挪动叶片，每浓度 8 张夹毒叶， 共 40 张。以点滴 1uL 丙酮再与涂有浆糊的圆叶对贴的叶片做对照。 2、饲喂幼虫： 每个培养皿放入一片夹毒叶，用湿棉花团置于皿中保湿，每个培养皿放进一头已称好重 量的幼虫，让其取食。所有培养皿按顺序编号，记录虫的体重，2 小时后检查取食情况。凡 是吃完夹毒叶的投放清洁的无毒甘蓝叶继续饲喂，凡是未吃完夹毒叶的，则弃去此虫，不计 入试验虫中，置于 25℃恒温箱内保持 24 小时后检查试虫生存或死亡情况并记录