1.蛋白标准品的准备a.取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20C长期保存。b.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl25mg/ml蛋白标准，加入980ul稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCI或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20℃C长期保存。2.BCA工作液的配制根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5mlBCA试剂A加100ulBCA试剂B，混匀，配制成5.1mlBCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定
1. 蛋白标准品的准备 a. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制 成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存。 b. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20µl 25mg/ml蛋白 标准，加入980µl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中， 标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl或PBS稀释 标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20 ℃长期保存。 2. BCA工作液的配制 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作 液，充分混匀。例如5ml BCA试剂A加100µl BCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。BCA工作液室温24小时内稳定
3.蛋白浓度检测a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20ul，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。b.加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20ul，加标准品稀释液补足到20ul。请注意记录样品体积。C.各孔加入200ulBCA工作液，37℃C放置20-30分钟。注：也可以室温放置2小时，或60C放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。d.用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的波长的吸光度，562nm最佳。e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度
3. 蛋白浓度检测 a. 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20µl加到96孔板的标准品孔中，加标准 品稀释液补足到20µl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.5mg/ml。 b. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20µl，加标准品稀释液补 足到20µl。请注意记录样品体积。 c. 各孔加入200µl BCA工作液，37ºC放臵20-30分钟。 注: 也可以室温放臵2小时，或60ºC放臵30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会 随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低， 适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。 d. 用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的波长的吸光度，562nm最佳。 e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度
Western Blotting胶的制备结果分析上样显影25电泳孵育二抗T转膜封闭孵育一抗
Western Blotting 胶的制备 上样 电泳 封闭 孵育二抗 显影 转膜 孵育一抗 结果分析