哺乳动物离体贴壁细胞的传代培养 SCHOO
哺乳动物离体贴壁细胞的传代培养
目的 1·熟悉实验原理 2 掌握细胞传代的操作 3 学习细胞计数
1 • 熟悉实验原理 2 • 掌握细胞传代的操作 3 • 学习细胞计数 目的
实验原理 细胞生长类型: ◎生长的细胞 贴壁型细胞:附着在某一固相支持物表面才能 县 悬浮状态下節可 牌必附着于固相支持物表面,在 數细胞类型棗螽瘟翱磨纽瞿挐态下星。 但是为什么贴壁细胞能贴壁,是否思考过? 为什么要传代 細胞在培养瓶中长成致密单层后,已基本饱 为使细 续生 传代培养 保存下丢的方 法,也是利用培养细胞迸行客种实的必经过程
一、实验原理 • 细胞生长类型： ——贴壁型细胞：附着在某一固相支持物表面才能 生长的细胞。 ——悬浮型细胞：不必附着于固相支持物表面，在 悬浮状态下即可生长的细胞。 ——绝大多数有机体细胞属于贴壁型细胞，只有少 数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 ——但是为什么贴壁细胞能贴壁，是否思考过？ • 为什么要传代： ——细胞在培养瓶中长成致密单层后，已基本饱和； 为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就要进行 传代（再培养）。传代培养使一种将细胞株保存下去的方 法，也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程
实验原理一—贴壁生长细胞的 生长过程 游离期or悬浮期 细胞接种后在培养基中处于悬浮状态,细胞质回缩, 胞体呈圆球形。 贴壁期: 细胞附着于胶原、玻璃、塑料或其它细胞等底物上, 细胞株平均于10min-4h贴壁 ·潜伏期: 细胞有生长活动,但无细胞分裂,一般为6-24h。 ·对数生长期 一细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳;适合进行各种实验 平台期: 细胞长满瓶底后,虽有活力但不再分裂
一、实验原理——贴壁生长细胞的 生长过程 • 游离期or悬浮期： ——细胞接种后在培养基中处于悬浮状态，细胞质回缩， 胞体呈圆球形。 • 贴壁期： ——细胞附着于胶原、玻璃、塑料或其它细胞等底物上， 细胞株平均于10min－4h贴壁。 • 潜伏期： ——细胞有生长活动，但无细胞分裂，一般为6-24h。 • 对数生长期： ——细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳；适合进行各种实验。 • 平台期： ——细胞长满瓶底后，虽有活力但不再分裂
二、实验准备一—试剂配制or购买 培养基 不同细胞有不同的适合培养基,养细胞前需查清楚。大多数培养基中使 用酚红作为pH指示剂红色代表中性,黄色代表酸性,紫色代表碱性。 很多细胞的培养基中需要加入血清:血清最好放置在-20℃,解冻时应 先置于4℃融解,融解过程必须规则摇晃均匀。(思考:血清是否应该灭活?) 此次实验为RPM1640完全培养基(需添加5% NaHco3,小牛血清, 霉素,链霉素和谷氨酰胺) 缓冲液 -一—磷酸盐溶液( Phosphate Buffered Saline,PBS)、 Hanks液orD- Hanks 液 消化液 可以使用0.25%胰酶、0.05%胰酶 for edta溶液;若胰酶是自己配制,则 要用不含钙、镁离子及血清的平衡盐溶液。 添加剂 谷氨酰胺:合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺,作为核酸和蛋白质 的合成原料;注意:其在溶液中很不稳定,4℃仅能存放两周。 HEPES:羟乙基哌嗪乙硫磺酸,用于防止培养基p迅速变动
二、实验准备——试剂配制or购买 • 培养基 ——不同细胞有不同的适合培养基，养细胞前需查清楚。大多数培养基中使 用酚红作为pH指示剂红色代表中性，黄色代表酸性，紫色代表碱性。 ——很多细胞的培养基中需要加入血清：血清最好放置在-20℃，解冻时应 先置于4℃融解，融解过程必须规则摇晃均匀。（思考：血清是否应该灭活？） ——此次实验为RPMl1640完全培养基（需添加5％NaHCO3，小牛血清， 青霉素，链霉素和谷氨酰胺）。 • 缓冲液 ——磷酸盐溶液（Phosphate Buffered Saline,PBS）、Hanks液or D-Hanks 液 • 消化液 ——可以使用0.25%胰酶、0.05%胰酶or EDTA溶液；若胰酶是自己配制，则 要用不含钙、镁离子及血清的平衡盐溶液。 • 添加剂 ——谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，作为核酸和蛋白质 的合成原料；注意：其在溶液中很不稳定，4℃仅能存放两周。 ——HEPES：羟乙基哌嗪乙硫磺酸，用于防止培养基pH迅速变动