而且对更远的碱基也有要求,因此,Ⅱ类酶既具有专一性,也具有 专 性,一般在识别序列内切割。切割的方式有 ,产生末端的 DNA片段或 的DNA片段。作用时需要作辅助因子,但不需要 和 完全的回文序列具有两个基本的特点,就是:(1) 71.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别 个碱基,也有识别多序列的限制性 内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析,限制性内切核酸酶识别 序列具有 倾向,即它们在识别序列中含量较高。 72.Ec丕是I类限制性内切核酸酶,分子组成是a2B2Y,分子量是300kDa。在这些 亚基中,a亚基具有 作用:β亚基具有 的活性; Y亚基的作用则是 73.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫 74.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的,第一个大写字母取自 ,第二、三两个字母取自 第四个 字母则用 表示。 75.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5’- GRCGYG-3’,其中R 76.在酶切反应管加完各种反应物后,需要离心2秒钟,其目的是 77.部分酶切可采取的措施有:(1) 等 第一个分离的限制性内切核酸酶差异是 而第一个用于构建重组 体的限制性内切核酸酶是 79.限制性内切核酸酶BsRⅠ和Hael的来源不同,但识别的序列都是 它们属于 80.由于DNA是由4种碱基组成的,所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值 应该是 81.SalI和MotI都是哺乳动物中识别序列稀有的酶,在哺乳动物基因组的5kb片 段中,找到NotI切点的概率是 82.部分酶切是指控制反应条件,使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割, 它的理论依据是 83.I类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的,切割位点的识别结合有 两种模型,一种是 另一种是 84限制性内切核酸酶通常保存在 浓度的甘油溶液中 85.连接酶( ligase)是一类用于核酸分子连接形成 键的核酸合成酶,有DNA 连接酶和RNA连接酶之分
56 而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有 专 一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有 ，产生末端的 DNA 片段或 的 DNA 片段。作用时需要作辅助因子，但不需要 和 。 70.完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1) (2) 。 71.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别 个碱基，也有识别多序列的限制性 内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别 序列具有 倾向，即它们在识别序列中含量较高。 72.EcoK 是 Ⅰ类限制性内切核酸酶，分子组成是α2β2γ，分子量是 300kDa。在这些 亚基中，α亚基具有 作用；β亚基具有 的活性； γ亚基的作用则是 。 73.个体之间 DNA 限制性片段长度的差异叫 。 74.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自 ，第二、三两个字母取自 ，第四个 字母则用 表示。 75.限制性内切核酸酶 Acy Ⅰ识别的序列是 5’－GRCGYG-3’，其中 R ， Ｙ 。 76.在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心 2 秒钟，其目的是 和 。 77.部分酶切可采取的措施有：(1) (2) (3) 等。 78.第一个分离的限制性内切核酸酶差异是 ；而第一个用于构建重组 体的限制性内切核酸酶是 。 79.限制性内切核酸酶 BsuR Ⅰ和ＨaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是 ， 它们属于 。 80.由于 DNA 是由 4 种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值 应该是 。 81.Sal Ⅰ和 Not Ⅰ都是哺乳动物中识别序列稀有的酶,在哺乳动物基因组的 5kb 片 段中，找到Ｎot Ⅰ切点的概率是 。 82.部分酶切是指控制反应条件，使得酶在 DNA 序列上的识别位点只有部分得到切割， 它的理论依据是 。 83.Ⅰ类限制酶识别 DNA 的位点和切割的 DNA 位点是不同的，切割位点的识别结合有 两种模型，一种是 ，另一种是 。 84.限制性内切核酸酶通常保存在 浓度的甘油溶液中。 85.连接酶(ligase)是一类用于核酸分子连接形成 键的核酸合成酶，有 DNA 连接酶和 RNA 连接酶之分
86.原核生物主要有两种类型的DNA连接酶:E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。 基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶,它是从T4噬菌体感染的E.coli中分 离的一种单链多肽酶,分子量为 kDa,由T4噬菌体基因 编 码。E. coli dNA连接酶是由大肠杆菌基因 编码,也是一条多肽链的 单体,分子量为 kDa。这两种DNA连接酶有两个重要的差异 第一是它们在催化反应中所用的能量来源不同,T4DNA连接酶用 而E. cOli dNA连接酶则用 作为能源。第二是它们催化平末 端连接的能力不同,在正常情况下只有性4DNA连接酶能够连接平末端,E. cOli DNA 连接酶则不能。即使是调整反应条件,E. cOli dNa连接酶催化平末端的连接效 率也只有T4DNA连接酶的 87.DNA连接酶的单位通常用 Weiss单位表示,一个 Weiss单位是: 88.DNA聚合酶Ⅰ是 在1965年从大肠杆菌细胞中分离的,所以 又称为 聚合酶。该酶由大肠杆菌基因 编码 是一种单链球蛋白,分子量为109kDa,酶蛋白中含有一个Zn原子。 89.T4DNA聚合酶与 Klenow酶一样,具有5→3’聚合酶和3’→5’外切酶两种活 性,但是它的3’→5’外切酶的活性比 Klenow酶强 倍。该酶的3 5’外切活性既能作用于单链DNA也能作用于双链DNA,不过作用于 链的活性要强于 0.反向转录酶( reverse transcriptase)是由 和 kDa两个亚 单位组成的二聚体,作用时以RNA为模板合成DNA 91.从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将 同时释放出游离的无机磷。催化反应时不需 但 需要引物,单链DNA是最好的引物,单链DNA受体的长度最短需有 个 dNTP。具有3’突出末端的双链DNA也是较好的反应底物。二价离子和DNA末端 状态对催化反应影响较大,但是用 作为辅助离子,可以催化任何形 式的末端(突出的、隐含的、平齐的)加接单核苷酸,但突出的3’端效率较高。以 Mn2/Mg2作为辅助因子,只能在单链DNA或双链DNA的3’突出端加尾c 92.S1核酸酶(S1 nuclease)是从米曲霉( Aspergillus oryzae)中分离纯化的一种含 的金属蛋白,分子量为32kDa,是一种耐热的酶(37-65℃)。 93.在S1保护实验中,S1切割的温度有两种:20℃和45℃,这是因为:在20℃时 在45℃时 技术可以用来鉴定DNA分子中与DNA结合蛋白相互作用 的特定序列。 95.真核生物有两种DNA连接酶,连接酶I主要是参与 而连接酶 Ⅱ则是参与 96.T4RNA连接酶是1972年发现的,并于1977年纯化。该酶是由T4噬菌体基因
57 86.原核生物主要有两种类型的 DNA 连接酶： E．coli DNA 连接酶和 T4 DNA 连接酶。 基因工程中使用的主要是 T4 DNA 连接酶，它是从 T4 噬菌体感染的 E．coli 中分 离的一种单链多肽酶，分子量为 kDa，由 T4 噬菌体基因 编 码。E．coli DNA 连接酶是由大肠杆菌基因 编码，也是一条多肽链的 单体，分子量为 kDa。这两种 DNA 连接酶有两个重要的差异： 第一是它们在催化反应中所用的能量来源不同，T4 DNA 连接酶用 ， 而 E．coli DNA 连接酶则用 作为能源。第二是它们催化平末 端连接的能力不同，在正常情况下只有 T4 DNA 连接酶能够连接平末端，E．coli DNA 连接酶则不能。即使是调整反应条件，E．coli DNA 连接酶催化平末端的连接效 率也只有 T4 DNA 连接酶的 。 87.DNA 连接酶的单位通常用 Weiss 单位表示，一个 Weiss 单位是： 。 88.DNA 聚合酶Ⅰ是 在 1965 年从大肠杆菌细胞中分离的，所以 又称为 聚合酶。该酶由大肠杆菌基因 编码， 是一种单链球蛋白，分子量为 109kDa，酶蛋白中含有一个 Zn 原子。 89.T4 DNA 聚合酶与 Klenow 酶一样，具有 5’→3’聚合酶和 3’→5’外切酶两种活 性，但是它的 3’→5’外切酶的活性比 Klenow 酶强 倍。该酶的 3’ → 5’外切活性既能作用于单链 DNA 也能作用于双链 DNA，不过作用于 链的活性要强于 链。 90.反向转录酶(reverse transcriptase)是由 kDa 和 kDa 两个亚 单位组成的二聚体，作用时以 RNA 为模板合成 DNA。 91．从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将 ， 同时释放出游离的无机磷。催化反应时不需 ，但 需要引物，单链 DNA 是最好的引物，单链 DNA 受体的长度最短需有 个 dNTP。具有 3’突出末端的双链 DNA 也是较好的反应底物。二价离子和 DNA 末端 状态对催化反应影响较大，但是用 作为辅助离子，可以催化任何形 式的末端(突出的、隐含的、平齐的)加接单核苷酸，但突出的 3’端效率较高。以 Mn2+／Mg2+作为辅助因子，只能在单链 DNA 或双链 DNA 的 3’突出端加尾。 92. S1 核酸酶(S1 nuclease)是从米曲霉(Aspergilluc oryzae)中分离纯化的一种含 的金属蛋白，分子量为 32kDa，是一种耐热的酶(37—65℃)。 93．在 S1 保护实验中， S1 切割的温度有两种：20℃和 45℃，这是因为：在 20℃时， ;在 45℃时， 。 94. 技术可以用来鉴定 DNA 分子中与 DNA 结合蛋白相互作用 的特定序列。 95.真核生物有两种 DNA 连接酶，连接酶Ⅰ主要是参与 ，而连接酶 Ⅱ则是参与 。 96．T4RNA 连接酶是 1972 年发现的，并于 1977 年纯化。该酶是由 T4 噬菌体基因
编码,作用是不需要模板。它在体内的作用是参与T4噬菌体 不 参与DNA合成的连接,但在 中可能有作用。 97.DNA聚合酶I的 Klenow大片段是用 切割DNA聚合酶I得到的分子 量为76KDa的大片段,具有两种酶活性:(1) 勺活性 98.反向转录酶除具有以DNA和RNA为摸板合成DNA的5’→3’合成酶的活性外, 还具有4种酶的活性:(1 (4) 99.RNA连接酶作用时除了需要ATP和Mg2外,还需要 100.DNA聚合酶Ⅰ是一种单体酶,分子量为109kDa,它含有金属离 子 101.为了防止DNA的自身环化,可用 脱去双 链DNA_ 102.T4单核苷酸激酶进行DNA片段的5’端标记时,主要是通过两种反应即 和 103.CIP催化脱磷酸时有两种最适温度,一种是37℃,适用于 端脱磷酸 另一种是56℃,适用于 端脱磷酸 104.λ外切核酸酶可从双链DNA的5’端依次切下5’单核背酸,但对不同末端的底 物来说,作用效率不同 最高, 最低 105.EGTA是 离子螯合剂。 106.测序酶是修饰了的T7DMA聚合酶,它只有 酶的活性,而没 有 酶的活性。 107.切口移位 nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用 的作用 108.欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式,通常可 采用 或 109.反转录酶除了催化DNA的合成外,还具有 的作用,可以将 DNA-RNA杂种双链中的 水解掉。 110.基因工程中有3种主要类型的载体: 111.由于不同构型的DNA插入EB的量不同,它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不 同, SC DNA的泳动速度 ,0CDNA泳动速度 DNA 居中,通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。 112.质粒的复制像染色体的复制一样,是从特定的起始点区开始的。然而,质粒的复 制可以是 向的、或是 向的。在杂种质粒中,每个复制子 的起点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地 位。并认为:当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后,在正常情 况下的复制起点可能被关闭
58 编码，作用是不需要模板。它在体内的作用是参与 T4 噬菌体 不 参与 DNA 合成的连接，但在 中可能有作用。 97．DNA 聚合酶 Ⅰ的 Klenow 大片段是用 切割 DNA 聚合酶Ⅰ得到的分子 量为 76KDa 的大片段，具有两种酶活性：(1) 。 (2) 的活性。 98．反向转录酶除具有以 DNA 和 RNA 为摸板合成 DNA 的 5’→3’合成酶的活性外， 还具有 4 种酶的活性：(1) ； (2) ； (3) ；(4) 。 99．RNA 连接酶作用时除了需要 ATP 和 Mg2+外，还需要 。 100 ．DNA 聚合酶 Ⅰ 是 一 种 单 体 酶 ， 分 子 量 为 109kDa ，它含有金属离 子 。 101. 为了防止 DNA 的自身环化，可用 脱去双 链 DNA 。 102．T4 单核苷酸激酶进行 DNA 片段的 5’端标记时，主要是通过两种反应即 和 。 103．CIP 催化脱磷酸时有两种最适温度，一种是 37℃，适用于 端脱磷酸； 另一种是 56℃，适用于 端脱磷酸。 104. λ外切核酸酶可从双链 DNA 的 5’端依次切下 5’单核背酸，但对不同末端的底 物来说，作用效率不同， 最高， 最低。 105．EGTA 是 离子螯合剂。 106．测序酶是修饰了的 T7 DNA 聚合酶，它只有 酶的活性，而没 有 酶的活性。 107．切口移位(nick translation)法标记 DNA 的基本原理在于利用 的 和 的作用。 108．欲将某一具有突出单链末端的双链 DNA 分子转变成平末端的双链形式，通常可 采用 或 。 109．反转录酶除了催化 DNA 的合成外，还具有 的作用，可以将 DNA-RNA 杂种双链中的 水解掉。 110．基因工程中有 3 种主要类型的载体： 、 、 。 111．由于不同构型的 DNA 插入 EB 的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不 同， SC DNA 的泳动速度 ，OC DNA 泳动速度 ， LDNA 居中，通过凝胶电泳和 EB 染色的方法可将不同构型的 DNA 分别开来。 112．质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点区开始的。然而，质粒的复 制可以是 向的、或是 向的。在杂种质粒中，每个复制子 的起点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地 位。并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情 况下的复制起点可能被关闭
113.就克隆一个基因(DNA片段)来说,最简单的质粒载体也必需包括三个部 分 另外,一个理想的质粒载体必须具有低分子量 114.如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中,则属于 群 这是因为它们的 所致。 115.质粒拷贝数是指细胞中 116.复制子由三部分组成:(1) (2) 117.酵母的2μm质粒有 可以配对形成哑铃结构。 118.一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后,一部分细胞中已测不 出质粒,这种现象叫 119.pBR322是一种改造型的质粒,它的复制子来源于 它的四环 素抗性基因来自于 它的氨苄青霉素抗性基因来自于 120.质粒的消失同染色体基因的突变是不同的,前者不能恢复,后者可以通过恢 复该基因的性状。 121. ColEl质粒复制的起始需要三种酶,即 122.YAC的最大容载能力是 BAC载体的最大容载能力是 123.pSC101是一种 复制的质粒 124.把那些没有可检测表型的质粒称为 125.转座子主要由下列部分组成:(1) (2) 126.pUC18质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过」 和 两种质粒改造而来。它的复制子来自 抗性基因则是来自 127在基因型的表示中,符号Ω表示 符号A表示 128.噬菌体之所以被选为基因工程载体,主要有两方面的原因: 是 二是 129.第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是φⅪ174,DNA长5386个碱基对,共个 基因,为一环状DNA分子,基因组的最大特点是 130.λ噬菌体的基因组DNA为 多个基因。在体内, 它有两种复制方式,扩增时(早期复制)按 复制,成熟包装(晚期 复制)则是按 复制。它有一个复制起点,进行 向复制 λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在,并且能够自然成环 其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个 个碱基组成的 天然粘性末端。这种粘性末端可以自然成环。成环后的粘性末端部位就叫做 位点。 131.根据噬菌体的包装能力,将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体,该 载体的最小分子大小约为 kb,插入的外源片段最大不超过
59 113 ．就 克隆 一 个基 因(DNA 片段) 来说 ， 最简 单的 质 粒载 体 也必 需包 括 三个 部 分： 、 、 。 另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 114．如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于 群， 这是因为它们的 所致。 115．质粒拷贝数是指细胞中 。 116. 复制子由三部分组成：(1) (2) (3) 。 117．酵母的 2μm 质粒有 ，可以配对形成哑铃结构。 118．一个带有质粒的细菌在有 EB 的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不 出质粒，这种现象叫 。 119．pBR322 是一种改造型的质粒，它的复制子来源于 ，它的四环 素抗性基因来自于 ，它的氨苄青霉素抗性基因来自于 。 120．质粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过 恢 复该基因的性状。 121．Co1El 质粒复制的起始需要三种酶，即 、 和 。 122．YAC 的最大容载能力是 ，BAC 载体的最大容载能力是 。 123．pSC101 是一种 复制的质粒。 124．把那些没有可检测表型的质粒称为 。 125．转座子主要由下列部分组成：(l) （2） (3) 。 126. pUC18 质粒是目前使用较为广泛的载体。 pUC 系列的载体是通过 和 两种质粒改造而来。它的复制子来自 ， Amp 抗性基因则是来自 。 127.在基因型的表示中，符号Ω表示 ；符号 A 表示 。 128. 噬 菌 体 之 所 以 被 选 为 基 因 工 程 载 体 ， 主 要 有 两 方 面 的 原 因 ： 一 是 ；二是 。 129.第一个报道的全测序的单链 DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共 个 基因，为一环状 DNA 分子，基因组的最大特点是 。 130.λ噬菌体的基因组 DNA 为 kb，有 多个基因。在体内， 它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按 复制，成熟包装(晚期 复制)则是按 复制。它有一个复制起点，进行 向复制。 λ噬菌体的 DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。 其原因主要是在λ噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个 个碱基组成的 天然粘性末端。这种粘性末端可以自然成环。成环后的粘性末端部位就叫做 位点。 131.根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组 DNA 改造成插入型载体，该 载体的最小分子大小约为 kb，插入的外源片段最大不超过 kb
132.野生型的M13不适合用作基因工程载体,主要原因是 133.粘粒( cosmid)是质粒-噬菌体杂合载体,它的复制子来自 点序列来自 最大的克隆片段达到 134.有两类改造型的λ噬菌体载体,即插入型和取代型。从酶切点看,插入型为 个 取代型为 135.野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体,原因是:(1) (3) 136.M13单链噬菌体的复制分为三个阶段:(1) 137.噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的,其中来自质粒的主要结构 是,而来自噬菌体的主要结构是 138.M3单链噬菌体基因2和基因4之间的IG区有三个最重要的功能,即(1) (3) 139.野生型的M13有10个基因,分为三个功能集团,其中与复制有关的两个基因是: 140.以λ噬菌体载体和粘粒载体构建文库时,起始DNA的长度是不同的,前者为 kb后者为 141.λ噬菌体载体由于受到包装的限制,插入外源DNA片段后,总的长度应在噬菌体 基因组的 的范围内 142.不同的宿主细胞其核酸酶的活性是不同的,如细菌中的HB101菌株及JM系列的 宿主菌所含核酸酶的活性比DH1、LE392等菌株 143.SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂,它有四个作用: 144.酚是蛋白变性剂,用酚抽提细胞DNA时,具有两方面的作用:(1) 145.用酚一氯仿抽提DNA时,通常要在氯仿或酚一氯仿中加少许异戊醇。这是因为: 异戊醇 另外,异戊醇有助 于分相,使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维 持稳定。 146.同其他水解蛋白酶相比,蛋白水解酶K具有两个显著的优点:(1) 147.在分离DNA时要使用金属离子整合剂,如EDTA和柠檬酸钠等,其目的是」 148.用乙醇沉淀DNA时,通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子,如NaCl和NaAc
60 132.野生型的 M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是 和 。 133.粘粒(cosmid)是质粒-噬菌体杂合载体，它的复制子来自 、cos 位 点序列来自 ，最大的克隆片段达到 kb。 134.有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为 个， 取代型为 个。 135.野生型的λ噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 136.M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) （2） (3) 。 137. 噬菌粒是由质粒和噬菌体 DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构 是 ，而来自噬菌体的主要结构是 。 138.M13 单链噬菌体基因 2 和基因 4 之间的 IG 区有三个最重要的功能，即(l) (2) (3) 。 139.野生型的 M13 有 10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是： 和 。 140.以λ噬菌体载体和粘粒载体构建文库时，起始 DNA 的长度是不同的，前者为 kb 后者为 kb。 141.λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源 DNA 片段后，总的长度应在噬菌体 基因组的 的范围内。 142.不同的宿主细胞其核酸酶的活性是不同的，如细菌中的 HB101 菌株及 JM 系列的 宿主菌所含核酸酶的活性比 DHl、 LE392 等菌株 。 143. SDS 是分离 DNA 时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用： (1) ； (2) ； (3) ； (4) 。 144.酚是蛋白变性剂，用酚抽提细胞 DNA 时，具有两方面的作用：(1) (2) 。 145.用酚—氯仿抽提 DNA 时，通常要在氯仿或酚—氯仿中加少许异戊醇。这是因为： 异戊醇 。另外，异戊醇有助 于分相，使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维 持稳定。 146.同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶 K 具有两个显著的优点：(1) (2) 。 147.在分离 DNA 时要使用金属离子整合剂，如 EDTA 和柠檬酸钠等，其目的是 。 148.用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在 DNA 溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 和 NaAc