七、问答题 1.阐述原核生物的转录终止 (1)转录终止的两种主要的机制是什么? (2)描述翻译怎样能调节转录终止 (3)为什么在细菌转录终止中很少涉及到Pho因子? (4)怎样能阻止转录的终止? 2.复制DNA的聚合酶(DNA依赖的DNMA聚合酶)也有校正功能,解释为什么RM聚合酶没有 这种功能。 3.讨论原核生物基因表达的聚合作用反应定向的重要性。假如核糖体从3’端到5’端读 它的模板mRNA的话,那么将会发生什么情况? 4.概括细菌细胞内的转录过程 5.概括典型原核生物启动子的结构和功能,并解释什么是保守序列。 6.转录如何在基因或基因组末端终止? 7.(1)如何区分由启动子起始转录的RNA片段与5’端被加工过的RNA片段 (2)证明多肽是从氨基端到羧基端方向合成的 8.比较E. coli rrna和tRNA的转录和加工。 9.区别可诱导和可阻遏的基因调控。 10.衰减作用如何调控E.cO中色氨酸操纵子的表达? 11.比较并指出细菌和真核生物RNA翻译机理的异同。 什么是摇摆假说 13.指出Ecol和真核生物翻译起始的不同。 14.S. N Cohen于1973年构建了三个重组体,pSC102,pSC105,pSC109请说明这三个 重组体是如何获得的?各说明了什么? 15.基因克隆是如何使含有单个基因的DNA片段得到纯化的? 6.什么是细菌的限制一修饰系统( restriction-modificaton system,R- M system) 17.细菌的限制一修饰系统有什么意义? 18.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 19.Ⅰ类限制酶具有哪些特点?在基因工程中有什么作用? 20.Ⅲ类限制酶有哪些特点? 21.何谓限制性内切核酸酶的切割频率? 22.什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响? 3.双酶消化法( double digests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理 24.什么是DNA多态性( DNA polymorphism)? 25.限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism,RFLP)。 26.计算下列三种酶各自在某染色体DNA序列上识别位点间的平均距离: AluI:5’AGCT3” EcoR I:5’ GAATTC3 3TCGA5′ 3′ CTTAGG5′ Acyl:5’ GPuCGPyC3
115 七、问答题 1．阐述原核生物的转录终止。 (1)转录终止的两种主要的机制是什么? (2)描述翻译怎样能调节转录终止。 (3)为什么在细菌转录终止中很少涉及到 Pho 因子? (4)怎样能阻止转录的终止? 2．复制 DNA 的聚合酶(DNA 依赖的 DNA 聚合酶)也有校正功能，解释为什么 RNA 聚合酶没有 这种功能。 3．讨论原核生物基因表达的聚合作用反应定向的重要性。假如核糖体从 3’端到 5’端读 它的模板 mRNA 的话，那么将会发生什么情况? 4．概括细菌细胞内的转录过程。 5. 概括典型原核生物启动子的结构和功能，并解释什么是保守序列。 6．转录如何在基因或基因组末端终止? 7．(1)如何区分由启动子起始转录的 RNA 片段与 5’端被加工过的 RNA 片段; (2)证明多肽是从氨基端到羧基端方向合成的。 8．比较 E．coli rRNA 和 tRNA 的转录和加工。 9．区别可诱导和可阻遏的基因调控。 10．衰减作用如何调控 E. coli 中色氨酸操纵子的表达? 11．比较并指出细菌和真核生物 RNA 翻译机理的异同。 12．什么是摇摆假说? 13．指出 E.coli 和真核生物翻译起始的不同。 14．S．N Cohen 于 1973 年构建了三个重组体， pSC102， pSC105， pSC109 请说明这三个 重组体是如何获得的?各说明了什么? 15．基因克隆是如何使含有单个基因的 DNA 片段得到纯化的? 16．什么是细菌的限制—修饰系统(restriction-modificaton system, R-M system) 17．细菌的限制—修饰系统有什么意义? 18．说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 19．Ⅰ类限制酶具有哪些特点?在基因工程中有什么作用? 20．Ⅲ类限制酶有哪些特点? 21．何谓限制性内切核酸酶的切割频率? 22．什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响? 23．双酶消化法(double digests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。 24．什么是 DNA 多态性(DNA polymorphism)? 25．限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。 26．计算下列三种酶各自在某染色体 DNA 序列上识别位点间的平均距离： Alu Ⅰ：5’AGCT 3” EcoR Ⅰ: 5’GAATTC 3’ 3 TCGA 5’ 3’CTTAGG 5’ AcyⅠ:5’GPuCGPyC 3’
3’ CPyGCPu5 (注:Py=任何一种嘧啶:Pu=任何一种嘌呤) 27.在细菌质粒pBP1的四环素抗性基因tet"的中间有一个ind的切点。用Binl切 割果蝇基因组DNA,以pBPⅠ为载体构建基因组文库。分子杂交证明克隆15带有果蝇 的目的基因。用Hinl和EcRV对克隆15进行了酶切分析,电泳结果如图15.1(用酶 切的pBP1质粒DNA作对照),旁边标出了片段的大小 图15.1酶切电泳图谱 1~2:HinM切割:;3~4:EcRV切割;5~6:HindⅢ+EcoR 1、3、5是质粒DNA:2、4、6是15号克隆。 (1)绘制含有插入片段和不含插入片段时的pBPⅠ的限制性图谱,并标明四环素抗性 基因的位置 (2)如果用克隆在另一个与pBP1完全不同源载体上的四环素抗性基因作为探针,进行 outhern印迹杂交,预测上述电泳图会出现什么样的杂交带? (3)如果用克隆15的果蝇DNA片段作为探针进行 Southem印迹杂交,放射自显影的 结果又是如何? 28.为什么大多数内切酶被称为“限制”酶 29.据 Science杂志报道:一种重要的遗传疾病可由导致DMA中碱基替换的诱变剂在体外进 行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。 116
116 3’CPyGCPu5’ (注： Py=任何一种嘧啶； Pu=任何一种嘌呤) 27．在细菌质粒 pBP1 的四环素抗性基因 tetR 的中间有一个 HindⅡ的切点。用 HindⅢ 切 割果蝇基因组 DNA，以 pBP1 为载体构建基因组文库。分子杂交证明克隆 15 带有果蝇 的目的基因。用 HindⅢ和 EcoRV 对克隆 15 进行了酶切分析，电泳结果如图 15.1(用酶 切的 pBP1 质粒 DNA 作对照)，旁边标出了片段的大小。 (1)绘制含有插入片段和不含插入片段时的 pBPl 的限制性图谱，并标明四环素抗性 基因的位置—; (2)如果用克隆在另一个与 pBP1 完全不同源载体上的四环素抗性基因作为探针，进 行 Southern 印迹杂交，预测上述电泳图会出现什么样的杂交带? (3)如果用克隆 15 的果蝇 DNA 片段作为探针进行 Southem 印迹杂交，放射自显影 的 结果又是如何? 28．为什么大多数内切酶被称为“限制”酶。 29．据 Science 杂志报道:一种重要的遗传疾病可由导致 DNA 中碱基替换的诱变剂在体外进 行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。 图 15.1 酶切电泳图谱 1～2：HindⅢ 切割；3～4：ＥcoRV 切割；5～6：Hind Ⅲ+Ｅco RV； 1、3、5 是质粒 DNA： 2、4、6 是 15 号克隆
30.为了绘制长为3.0 kb Band I限制性片段的限制性图谱,分别用 EcoR I、HpaⅡEcOR 十a消化这一片段的三个样品,然后通过凝胶电泳分离DNA片段,溴化乙锭染 图15.2用EcRI、aⅡ单独切割及用这两种酶混合切割30kb BamI片段产生的DNA带 色后观察DNA带型(图15.2)。请根据这些结果,绘制一个限制性图谱,要标明E.cOR 和a识别位点间的相对位置,以及它们之间的距离(kb)。 1.1967年,有5个实验室几乎同时独立发现了DNA连接酶,每个实验室的实验有什么 特点? 32.简述DNA和RNA连接酶的催化反应机制。 33.影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些? 34.什么是 Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用? 35.如何利用T4DNA聚合酶制备3’隐含末端或双链平末端? 36.如何利用T4DNA聚合酶进行双链DNA的3’末端标记? 37.如何利用T4DNA聚合酶制备平末端? 8.反转录酶有两种类型,一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMWY, aviam myeloblastosis vIrus),另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒(M-MLV, Moloney murine leukemia virus),它们之间有什么不同? 39.与E. colirna聚合酶相比,细菌噬菌体的SP6RN聚合酶、T7RNA聚合酶和T3RNA 聚合酶具有哪些优越性 40.什么是多核苷酸激酶的向前反应和交换反应 41.细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途 42.λ外切核酸酶(1 ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用? 43.Mn2、Mg2对 DNase I( deoxyribonuclease I)的活性有什么影响? DNase I在基因 工程中有什么作用 44.比较S1- Mapping和 Footprinting在原理上、方法上、应用上有何不同? l17
117 30．为了绘制长为 3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用 EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ EcoR Ⅰ十 HpaⅡ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离 DNA 片段，溴化乙锭染 色后观察 DNA 带型(图 15.2)。请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明 E.coR Ⅰ 和 HpaⅡ识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离(kb)。 31．1967 年，有 5 个实验室几乎同时独立发现了 DNA 连接酶，每个实验室的实验有什么 特点? 32．简述 DNA 和 RNA 连接酶的催化反应机制。 33. 影响 DNA 连接酶催化连接反应的因素有哪些? 34．什么是 Klenow 酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用? 35. 如何利用 T4 DNA 聚合酶制备 3’隐含末端或双链平末端? 36. 如何利用 T4 DNA 聚合酶进行双链 DNA 的 3’末端标记? 37．如何利用 T4 DNA 聚合酶制备平末端? 38．反转录酶有两种类型，一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMY, aviam myeloblastosis virus)，另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒(M—MLV，Moloney murine leukemia virus)，它们之间有什么不同? 39．与 E.coli RNA 聚合酶相比，细菌噬菌体的 SP6RNA 聚合酶、 T7 RNA 聚合酶和 T3 RNA 聚合酶具有哪些优越性? 40．什么是多核苷酸激酶的向前反应和交换反应? 41．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途? 42．λ外切核酸酶(lambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用? 43．Mn2+、 Mg2+对 DNase Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ)的活性有什么影响? DNase Ⅰ在基因 工程中有什么作用? 44．比较 S1-Mapping 和 Footprinting 在原理上、方法上、应用上有何不同? 图 15.2 用 EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ单独切割及用这两种酶混合切割 30kb BamHⅠ片段产生的 DNA 带
45.什么是复制子( replicon)? 46.什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么? 47.什么是质粒的带动转移? 48.说明变性定位法和限制性内切核酸酶定位法研究质粒复制起点的原理, 49. Colel衍生质粒拷贝数调节机理的机理是什么? 50.R1质粒拷贝数受到怎样的调节控制 51.质粒如何维持在细胞中的稳定? 52.引起质粒不相容性的主要原因是什么? 53.由于基因工程是人为改变遗传信息的操作,因此必须注意被操作基因的安全,进行严 格的监控,质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方 54.请指出质粒pSC101的一些生物学特性(包括结构和遗传)及在基因工程中的作用 55.自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多,即使是ColE1和pSC101这两个自然质 粒也不尽人意,通常需要进行改造,请问质粒改造包括哪些基本内容? 56.质粒改造的发展过程如何? 57.在质粒中如何增减酶切点? 58.有人用限制性内切核酸酶EcORⅠ分别切割松弛型质粒 Colel和严紧型质粒pSCl01(各 有一个切点),然后重组连接形成一个杂种质粒pSC134,请推测这种质粒有什么特性 和用途 59.现分离了4种新的大肠杆菌Hfr菌株,通过中断接合实验,针对每一菌株确定了高频 转移的标记基因和它们进入F受体的时间分别为 Hfrl Hfr2 Hfr3 Hfrs 13min 1 16 6 标记基因和第 arg 次进入的时间hs put his gal (gal、lac、ml、皿a不能发酵半乳糖、乳糖、麦芽糖和甘露糖:arg、his、met、trp 生长需要精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、嘌呤和色氨酸;u:紫外线敏感) 任何没有给出的标记都是不能高频转移的。上述数据能够说明大肠杆菌的染色体是环 状的吗?以分钟表示图距构建一个大肠杆菌染色体的连锁图。假定整个染色体用了100 分钟转移,而且苏氨酸被认为位于0分钟或100分钟处 0.YAC克隆载体常出现哪些问题? 61.为什么野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体? 62.什么是蓝白斑筛选法? 63.蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性 64.什么是cI筛选法? 65.λ噬菌体载体具有哪些优点与不足? l18
118 45．什么是复制子(replicon)? 46．什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么? 47．什么是质粒的带动转移? 48．说明变性定位法和限制性内切核酸酶定位法研究质粒复制起点的原理。 49． Co1El 衍生质粒拷贝数调节机理的机理是什么? 50． R1 质粒拷贝数受到怎样的调节控制? 51．质粒如何维持在细胞中的稳定? 52. 引起质粒不相容性的主要原因是什么? 53．由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行 严 格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方 面? 54．请指出质粒 pSC101 的一些生物学特性(包括结构和遗传)及在基因工程中的作用。 55. 自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是 Co1E1 和 pSC101 这两个自然质 粒也不尽人意，通常需要进行改造，请问质粒改造包括哪些基本内容? 56. 质粒改造的发展过程如何? 57. 在质粒中如何增减酶切点? 58．有人用限制性内切核酸酶 EcoR I 分别切割松弛型质粒 Co1E1 和严紧型质粒 pSC101(各 有一个切点)，然后重组连接形成一个杂种质粒 pSC134，请推测这种质粒有什么特性 和用途。 59．现分离了 4 种新的大肠杆菌 Hfr 菌株，通过中断接合实验，针对每一菌株确定了高频 转移的标记基因和它们进入 F —受体的时间分别为： 标记基因和第一 次进入的时间 Hfr1 Hfr2 Hfr3 Hfr4 man 13min mal 29 lys 16 pur 6 trp 6 met 14 arg 9 trp 3 his 23 thr 4 mal 2 thr 31 pur 3 uvr 20 his 32 lac 23 gal 14 (gal、lac、mal、man 不能发酵半乳糖、乳糖、麦芽糖和甘露糖；arg、his、met、trp 生长需要精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、嘌呤和色氨酸；uvr：紫外线敏感)。 任何没有给出的标记都是不能高频转移的。上述数据能够说明大肠杆菌的染色体是环 状的吗?以分钟表示图距构建一个大肠杆菌染色体的连锁图。假定整个染色体用了 100 分钟转移，而且苏氨酸被认为位于 0 分钟或 10O 分钟处。 60．YAC 克隆载体常出现哪些问题? 61．为什么野生型的λ噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体? 62．什么是蓝白斑筛选法? 63．蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性? 64．什么是 cⅠ筛选法? 65．λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?
66.什么是M3的IG序列区?有何特点和功能? 67.将野生型的M13改造成基因工程载体,首先是进行酶切位点的改造,请问M13中的EcOR I最初是如何引入的? 68.以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时,为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体? 69.M3系列载体具有哪些优缺点? 0.粘粒载体具有哪些特点与不足? 71.辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的? 72.克隆的DNA在质量上有什么要求? 73.为什么从细胞中分离DNA时往往会断裂? 74.为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离? 75.为什么氧化变色的酚不能直接用于DNA的分离?应如何处置? 76.在DNA分离过程中,酚通常与氯仿联合使用,即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯 仿再抽提一次,为什么? 77.说明溴化乙锭一氯化钩密度梯度离心( ethidium bromide- caesium chloride gradient centrifugation)纯化DNA的原理。 78.采用什么措施保证DNA化学合成的定时性和专一性? 79.何谓简并引物( degenerate primer)? 80.简并引物设计的一般原则是什么? 81.双脱氧法( dideoxynucleotide method)测序的基本原理是什么? 2.在古生物学中,尚不知道恐龙是否是温血爬行动物,而不像今天的变温爬行动物。假 如你得到一些恐龙的DNA,你如何通过PCR和基因克隆来检测恐龙是否是温血爬行 动物? 83.如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成,可以通过何种方法 克隆该基因? 84.何谓定位克隆( positional cloning)? 85.何谓染色体步移( chromosome walking)? 在染色体步移中,用哪些方法获得克隆的末端? 87.何谓表型克隆( phenotype cloning) 什么是基 89.什么是基因组文库( genomic library)?构建基因组文库,涉及哪些基本过程?它同遗传 学上的基因库有什么不同? 90.什么是cDNA文库( complement DNa libraly)?同基因组文库有何差别? 91.粘性末端连接法是最常用的连接方法,具有许多优点,但是也有一些不足,请指出这 些不足之处 92.什么是同聚物加尾连接法( homopo lymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优 缺点? 3.何谓接头连接法( Linker ligation)? 94.什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高 95.如何使用甲基化酶对克隆DNA进行保护?有什么意义?
119 66．什么是 M13 的 IG 序列区?有何特点和功能? 67．将野生型的 M13 改造成基因工程载体，首先是进行酶切位点的改造，请问 M13 中的 EcoR Ⅰ最初是如何引入的? 68．以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体? 69． M13 系列载体具有哪些优缺点? 70．粘粒载体具有哪些特点与不足? 71．辅助噬菌体 DNA 和相应的噬菌粒是如何协同工作的? 72. 克隆的 DNA 在质量上有什么要求? 73．为什么从细胞中分离 DNA 时往往会断裂? 74．为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于 DNA 的分离? 75．为什么氧化变色的酚不能直接用于 DNA 的分离?应如何处置? 76. 在 DNA 分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯 仿再抽提一次，为什么? 77. 说明溴化乙锭—氯化钩密度梯度离心(ethidium bromide-caesium chloride gradient centrifugation)纯化 DNA 的原理。 78. 采用什么措施保证 DNA 化学合成的定时性和专一性? 79．何谓简并引物(degenerate primer)? 80．简并引物设计的一般原则是什么? 81．双脱氧法(dideoxynucleotide method)测序的基本原理是什么? 82．在古生物学中，尚不知道恐龙是否是温血爬行动物，而不像今天的变温爬行动物。 假 如你得到一些恐龙的 DNA，你如何通过 PCR 和基因克隆来检测恐龙是否是温血 爬行 动物? 83．如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法 克隆该基因? 84．何谓定位克隆(positional cloning)? 85．何谓染色体步移(chromosome walking)? 86．在染色体步移中，用哪些方法获得克隆的末端? 87．何谓表型克隆(phenotype cloning)? 88．什么是基因文库? 89．什么是基因组文库(genomic librarY)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传 学上的基因库有什么不同? 90．什么是 cDNA 文库(complement DNA libraly)?同基因组文库有何差别? 91．粘性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出 这 些不足之处， 92．什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优 缺点? 93．何谓接头连接法(Iinker ligation)? 94．什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高? 95．如何使用甲基化酶对克隆 DNA 进行保护?有什么意义?