(一)目的基因 How to get the target gene? 1.从mRNA合成cDNA 2.直接从染色体DNA或质粒中分离 2.从基因文库中筛选 3.化学合成 methods PcR法(聚合酶链式反应)
微生物与生化药学教研室 （一） 目的基因 How to get the target gene? 1. 从mRNA合成cDNA 2. 直接从染色体DNA或质粒中分离 2．从基因文库中筛选 3. 化学合成 methods： PCR法（聚合酶链式反应）
PCR TPCR原理:是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以 特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,按照 碱基互补配对的原则体外复制出与母链模板DNA互补的子链 DNA的过程 τ是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任 何目的DNA。 T如已知目的基因两端的序列,则可采用PCR技术,以基因组 DNA或∞DNA为模板,体外扩增获得目的基因
微生物与生化药学教研室 PCR PCR原理：是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以 特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，按照 碱基互补配对的原则体外复制出与母链模板DNA互补的子链 DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任 何目的DNA。 如已知目的基因两端的序列，则可采用PCR技术，以基因组 DNA或cDNA为模板，体外扩增获得目的基因
PCR 引物设计 T获得目的基因序列 T扩增目的基因序列全长; τ引入限制性核酸內切酶酶切位点; τ在引物5′末端加入限制性酶切位点序列时, 定要包含几个额外的碱基(2-6碱基)作为固定, 以防止5末端在消化时的移动
微生物与生化药学教研室 PCR 引物设计： 获得目的基因序列 扩增目的基因序列全长； 引入限制性核酸内切酶酶切位点； 在引物5’末端加入限制性酶切位点序列时，一 定要包含几个额外的碱基（2-6碱基）作为固定， 以防止5’末端在消化时的移动
PCR引物设计中引入限制性核酸内切酶酶切位点 限制性核酸内切酶( restriction endonuclease)是识别双链DNA分子中的特定 核苷酸序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。基因操作中 的”分子手术刀“ Cleavage EcoRI Sticky ends GC5 DNA连接酶 限制性核酸内切酶的类型 根据限制性内切酶的识别位点和切割位点以及所需要的辅助因子,可分三类 I型:切割位点不确定,不适合基因工程操作 Ⅱ型:识别双链DNA上的一段明确的序列,并在识别位点之内进行切割,基因工捍 工具酶 I型:切割位点不在识别位点,对分子克隆操作无意义
微生物与生化药学教研室 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是识别双链DNA分子中的特定 核苷酸序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。基因操作中 的”分子手术刀“。 限制性核酸内切酶的类型： 根据限制性内切酶的识别位点和切割位点以及所需要的辅助因子，可分三类： I型： 切割位点不确定，不适合基因工程操作 II型：识别双链ＤＮＡ上的一段明确的序列，并在识别位点之内进行切割，基因工程的 工具酶 III型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作无意义。 DNA连接酶 PCR引物设计中引入限制性核酸内切酶酶切位点
PCR引物设计中引入限制性核酸内切酶酶切位点 T需要考虑的问题 1.载体的选择:载体上有的酶切位点 2.使用酶切效率高的 3.使用双酶切有共同 buffer的酶 4.使用常见的酶 5.目的基因片段内部不含的酶切位点 6.不要使用同尾酶 7.在酶切位点5`端加入保护性碱基 8.是否需要起始密码子和终止密码子
微生物与生化药学教研室 需要考虑的问题： １.载体的选择：载体上有的酶切位点 ２.使用酶切效率高的 ３.使用双酶切有共同buffer的酶 4. 使用常见的酶 5. 目的基因片段内部不含的酶切位点 6. 不要使用同尾酶 7. 在酶切位点5｀端加入保护性碱基 8. 是否需要起始密码子和终止密码子 PCR引物设计中引入限制性核酸内切酶酶切位点