实验一荧光物质稀溶液的激发、发射和同步荧光光谱测定一，实验目的1.学习荧光分析法的基本原理和LS一55B发光分析仪的操作。2.学习同步荧光的操作，了解同步荧光的优点。二，实验原理荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。在一定光源强度下，若保持激发波长不变，扫描得到的荧光强度与发射波长2的关系曲线，称为荧光发射光谱：反之，保持元不变，扫描得到的荧光强度与的关系曲线，则称为荧光激发光谱。在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素有关。苯酚由于其共轭结构，有荧光活性，可以用荧光分析法测定。它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。对于复杂组分，当激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象时，可以用同步荧光扫描，同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提高选择性。三．实验仪器和试剂1.LS-55型发光谱仪；2.移液枪（德国BRAND公司生产）：3.50ml容量瓶，25ml容量瓶10支；4.苯酚储备液：960mg/L5.去离子水；四实验内容1.预扫描（pre-scan）用储备液配制浓度为10ppm（mo1/L）的工作液，设定仪器参数，进行全波长预扫描，并记录扫描结果，得出最大激发和发射波长，同时查看其瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。2.激发光谱、发射光谱和同步荧光扫描①设定合适的参数，分别对苯酚溶液进行荧光激发、发射和同步荧光光谱扫描。②取浓度为0.010（mo1/L）的工作液，扫描发射光谱，加水稀释后再在同样波长下扫描发射光谱，观察荧光猝灭效应。发射光谱参数：扫描波长范围200—750nm；Ex=214nm、270nm，扫描速度=1000nm/min，Ex-S1it=10nm，Em-slit=5nm，，记住取文件名。激发光谱参数：扫描波长范围200-750nm，=300nm、586nm，扫描速度=1000nm/min，Ex-Slit=10nm，Em-slit=5nm,记录信息。同步荧光光谱：扫描波长范围250-750nm，△入（-a）=30m、86nm，扫描速度=1000nm/min，Ex-S1it=10nm，Emslit=5nm，记录信息。3.三维荧光光谱扫描设定发射波长范围，激发开始波长，步长，测定数目，开始进行苯酚三维荧光光谱扫描。五，数据处理1.用实验获得的数据绘制苯酚的激发、发射、同步光谱。2．对比不同浓度下的苯酚的最大激发波长和最大发射波长处的峰高，了解荧光猝灭效应。取浓度为0.01（mo1/L）的苯酚溶液，固定激发光的波长为270nm，狭缝宽度为10.0nm，发射光的狭缝宽度为5.0nm，扫描波长范围250一750nm，扫速为1000nm/min，扫描荧光强度与发射光波长的关系曲线，所得曲线如下：
实验一 荧光物质稀溶液的激发、发射和同步荧光光谱测定 一. 实验目的 1.学习荧光分析法的基本原理和LS－55B发光分析仪的操作。 2.学习同步荧光的操作，了解同步荧光的优点。 二. 实验原理 荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性 分析和定量分析的方法，称为荧光分析。 在一定光源强度下，若保持激发波长 不变，扫描得到的荧光强度与发射波长 的关系曲线，称为荧光发射光 谱；反之，保持 不变，扫描得到的荧光强度与 的关系曲线，则称为荧光激发光谱。在一定条件下，荧光强度与物质浓 度成正比，这是荧光定量分析的基础。荧光分析的灵敏度不仅与溶液的浓度有关，而且与紫外光照射强度及所选测量波长等因素 有关。 苯酚由于其共轭结构，有荧光活性，可以用荧光分析法测定。它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。对于复 杂组分，当激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象时，可以用同步荧光扫描，同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，提 高选择性。 三. 实验仪器和试剂 1. LS-55型发光谱仪; 2. 移液枪(德国BRAND公司生产); 3. 50ml容量瓶，25ml容量瓶10支; 4. 苯酚储备液：960mg/L 5. 去离子水; 四. 实验内容 1.预扫描(pre-scan) 用储备液配制浓度为10ppm（mol/L）的工作液，设定仪器参数，进行全波长预扫描，并记录扫描结果，得出最大激发和发射 波长，同时查看其瑞利散射波长、以及双倍频峰波长。 2．激发光谱、发射光谱和同步荧光扫描 ①设定合适的参数，分别对苯酚溶液进行荧光激发、发射和同步荧光光谱扫描。 ②取浓度为0.010（mol/L）的工作液，扫描发射光谱，加水稀释后再在同样波长下扫描发射光谱，观察荧光猝灭效应。 发射光谱参数：扫描波长范围200—750nm；Ex=214nm、270nm，扫描速度=1000 nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,，记 住取文件名。 激发光谱参数：扫描波长范围200-750nm， =300nm、586nm，扫描速度=1000nm/min, Ex-Slit=10nm, Em-slit=5nm,记录 信息。 同步荧光光谱：扫描波长范围250-750nm, Δλ( - )=30nm、86nm,扫描速度=1000nm/min, Ex-Slit=10nm, Emslit=5nm,记录信息。 3．三维荧光光谱扫描 设定发射波长范围，激发开始波长，步长，测定数目，开始进行苯酚三维荧光光谱扫描。 五．数据处理 1．用实验获得的数据绘制苯酚的激发、发射、同步光谱。 2．对比不同浓度下的苯酚的最大激发波长和最大发射波长处的峰高，了解荧光猝灭效应。 取浓度为0.01（mol/L）的苯酚溶液，固定激发光的波长为270nm，狭缝宽度为10.0nm，发射光的狭缝宽度为5.0nm，扫描波长范围 250—750nm，扫速为1000nm/min，扫描荧光强度与发射光波长的关系曲线，所得曲线如下：
58家#3S###多务R#图7将溶液稀释后再以同样的条件扫描荧光强度与发射光波长的关系曲线，所得曲线如下：图8从图7与图8（图8中红色线是稀释前的曲线，蓝色线是稀释后的曲线）上可明显看出稀释后的峰的强度大了许多，这是由于在高浓度时一部分苯酚的发射光被自身吸收了，发生了荧光的猝灭，而浓度低时这种自身吸就大大减少，峰的强度反而变大。所以，荧光分析的浓度不能高。3.用MATLAB绘制三维荧光光谱。六。讨论与思考1.对待测溶液进行预扫描的有何作用？2.观察激发光波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？3同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。4.比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。实验二有机化合物红外光谱的测定一，实验目的通过红外吸收光谱的测定，掌握NicoletFT-IR的使用方法。三.实验原理本实验用NicoletFT-IR测定有机物以及高分子的红外吸收光谱。红外光谱作为“分子的指纹”广泛用于分子结构和物质化学组成的研究。根据分子对红外光吸收后得到谱带频率的位置、强度、形状以及吸收谱带和温度、聚集状态等的关系便可确定分子的空间构型，求出化学键的力常数、键长和键角。从光谱分析的
图7 将溶液稀释后再以同样的条件扫描荧光强度与发射光波长的关系曲线，所得曲线如下： 图8 从图7与图8（图8中红色线是稀释前的曲线，蓝色线是稀释后的曲线）上可明显看出稀释后的峰的强度大了许多，这是由于在高浓度 时一部分苯酚的发射光被自身吸收了，发生了荧光的猝灭，而浓度低时这种自身吸就大大减少，峰的强度反而变大。所以，荧光分 析的浓度不能高。 3.用MATLAB绘制三维荧光光谱。 六．讨论与思考 1．对待测溶液进行预扫描的有何作用？ 2．观察激发光波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行定量分析？ 3．同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较他们的不同，并解释原因。 4．比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点。 实验二 有机化合物红外光谱的测定 一.实验目的 通过红外吸收光谱的测定，掌握Nicolet FT-IR的使用方法。 二.实验原理 本实验用Nicolet FT-IR测定有机物以及高分子的红外吸收光谱。 红外光谱作为“分子的指纹”广泛用于分子结构和物质化学组成的研究。根据分子对红外光吸收后得到谱带频率的位置、强 度、形状以及吸收谱带和温度、聚集状态等的关系便可确定分子的空间构型，求出化学键的力常数、键长和键角。从光谱分析的
角度看主要是利用特征吸收谱带的频率推断分子中存在某一基团或键，由特征吸收谱带频率的变化推测临近的基团或键，进而确定分子的化学结构，当然也可由特征吸收谱带强度的改变对混合物及化合物进行定量分析。IUNALL%--15.对苯二酚的红外吸收谱图如上，可以看到在3500cm-处有个大的吸收峰，这是羟基的吸收峰，3000cm-1左右是C-H的吸收峰，1500cm-1是C=C的吸收峰。三.实验仪器和试剂6.NicoletFT-IR傅立叶红外光谱仪（美国热电公司，Thermo);7.压片机（美国热电公司）：8.多功能反射头（美国热电公司）9.对苯二酚10.聚苯乙烯薄膜：11.自备样品（塑料）：12.KBr固体四.实验内容13.空气中C02的测定（1）实验步骤：不放样品的情况下测试空气中的红外吸收谱图，在不扣除背景的情况下在nm下可以看到CO2的红外吸收谱图，在分辨率为4cm-1和1cm-1两种情况下分别测试。（2）分析两种分辨率下的谱图的异同。观察C02的红外吸收精细结构。14.Bbe15.维生素C的测定（1）压片：将少量维生素C固体加入到KBr粉末中，碾碎并拌匀，用压片机压成薄片。（2）测试：将压好的样品薄片放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景
角度看主要是利用特征吸收谱带的频率推断分子中存在某一基团或键，由特征吸收谱带频率的变化推测临近的基团或键，进而确 定分子的化学结构，当然也可由特征吸收谱带强度的改变对混合物及化合物进行定量分析。 对苯二酚的红外吸收谱图如上，可以看到在3500cm-1处有个大的吸收峰，这是羟基的吸收峰，3000 cm-1左右是C-H的吸收峰， 1500 cm-1是C=C的吸收峰。 三.实验仪器和试剂 6. Nicolet FT-IR傅立叶红外光谱仪（美国热电公司， Thermo）; 7. 压片机（美国热电公司）; 8. 多功能反射头（美国热电公司） 9. 对苯二酚 10.聚苯乙烯薄膜； 11.自备样品（塑料）; 12.KBr固体 四.实验内容 13.空气中CO2的测定 （1）实验步骤： 不放样品的情况下测试空气中的红外吸收谱图，在不扣除背景的情况下在nm下可以看到CO2的红外吸收谱图，在分辨率为 4cm-1和1cm-1两种情况下分别测试。 （2）分析两种分辨率下的谱图的异同。观察CO2的红外吸收精细结构。 14. 15.维生素C的测定 （1）压片：将少量维生素C固体加入到KBr粉末中，碾碎并拌匀，用压片机压成薄片。 （2）测试：将压好的样品薄片放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景
（3）谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看是不是自己测得的物质，并记录匹配度：分析谱图，将各种官能团指出来。16.聚苯乙烯薄膜的测定（1）测试：将聚苯乙烯薄膜放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。（3）谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看是不是自己测得的物质，并记录匹配度：分析谱图，将各种官能团指出来。17.自备样品（透明塑料薄膜）的测定（1）红外吸收谱图的测定：测试：将自备塑料样品放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看自己测得的是何种物质，并记录匹配度：分析谱图，将各种官能团指出来。实验三多元校正一分光光度法同时测定混合色素一。目的1．了解矢量数据的获取方法及其在多组分测定中的应用。2.了解计算机技术及化学计量学基本方法在波谱解析中的应用。二、原理食用合成色素是饮料等食品中的常用添加剂，但合成色素具有一定的毒性，过量使用有害健康。因此，色素的分析对食品工业具有重要意义。由于色素对可见光有较强吸收，故分光光度法是测定色素的基本方法。但当有多种色素同时存在时，通常要借助薄层层析等方法使各组分分离后，才能进行定量测定。这使得测定步骤十分烦琐。化学计量学方法为混合色素不经分离进行准确地同时测定提供了可能。设有nc个组分同时存在，配制一组已知样本共ns个溶液，其浓度矩阵为Cnc×ns，在nw个波长下测得吸光度矩阵AnwXns。根据朗伯一比耳定律有：(1)A=KCmc其中KnwXnc为吸光度矩阵，根据最小二乘法原理可求出各组分的纯物种谱，即K矩阵：(2)K=AC'(CC)式（2）中t和-1分别表示该矩阵的转置和逆。对于一个或一组未知样，同样在n个相同波长下测定后，可用最小二乘法根据下式求出未知物的浓度。(3)C++-(K'E)-K'A+三．仪器与试剂1.仪器722分光光度仪、Agilent8453UV-VIS分光光度仪6个4支容量瓶：50ml移液管：5ml2.试剂2.1胭脂红溶液（120mg/L）：称取0.120g胭脂红用纯水溶解后定容至1L。2.2柠檬黄溶液（100mg/L）：配制方法参考2.1。2.3日落黄溶液（100mg/L）：配制方法参考2.1。2.4HC1（0.1mo1/L）：量取16.6mL盐酸（A.R.）用纯水定容至2000mL
（3）谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看是不是自己测得的物质，并记录匹配度；分析谱图，将各种官能 团指出来。 16.聚苯乙烯薄膜的测定 （1）测试：将聚苯乙烯薄膜放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。 （3）谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看是不是自己测得的物质，并记录匹配度；分析谱图，将各种官能 团指出来。 17.自备样品（透明塑料薄膜）的测定 （1）红外吸收谱图的测定： 测试：将自备塑料样品放置在红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，需要扣除背景。 谱图解析：将测得的谱图在谱图库中查询比对，看看自己测得的是何种物质，并记录匹配度；分析谱图，将各种官能团指出 来。 实验三 多元校正－分光光度法同时测定混合色素 一. 目的 1. 了解矢量数据的获取方法及其在多组分测定中的应用。 2. 了解计算机技术及化学计量学基本方法在波谱解析中的应用。 二. 原理 食用合成色素是饮料等食品中的常用添加剂，但合成色素具有一定的毒性，过量使用有害健康。因此，色素的分析对食品工业 具有重要意义。由于色素对可见光有较强吸收，故分光光度法是测定色素的基本方法。但当有多种色素同时存在时，通常要借助薄 层层析等方法使各组分分离后，才能进行定量测定。这使得测定步骤十分烦琐。化学计量学方法为混合色素不经分离进行准确地同 时测定提供了可能。 设有nc个组分同时存在，配制一组已知样本共ns个溶液，其浓度矩阵为Cnc×ns，在nw个波长下测得吸光度矩阵Anw×ns。根据 朗伯—比耳定律有： (1) 其中Knw×nc为吸光度矩阵，根据最小二乘法原理可求出各组分的纯物种谱，即K矩阵： (2) 式（2）中t和-1分别表示该矩阵的转置和逆。对于一个或一组未知样，同样在nw个相同波长下测定后，可用最小二乘法根据下式求 出未知物的浓度。 (3) 三. 仪器与试剂 1. 仪器 722分光光度仪、Agilent8453UV-VIS分光光度仪 容量瓶：50ml 6个 移液管：5ml 4支 2. 试剂 2.1 胭脂红溶液（120mg/L）：称取0.120g胭脂红用纯水溶解后定容至1L。 2.2 柠檬黄溶液（100mg/L）：配制方法参考2.1。 2.3 日落黄溶液（100mg/L）：配制方法参考2.1。 2.4 HCl（0.1 mol/L）：量取16.6mL盐酸（A.R.）用纯水定容至2000mL
四．实验部分1.混合色素的测定要求同学根据下列提示，自己设计实验步骤，并测定三份未知混合样。1.1测定食用色素的吸光度，必须控制pH值，建议控制酸度为CHC1=0.01mol·L-1(pH=2.0)。1.2在酸性条件下，三种色素的最大吸收波长和吸光系数的参考值如下：日落黄柠檬黄胭脂红480510400入max/nm313320K/ (L-g-l.cm-l)1.3标准溶液建议配制6份。每份溶液中各组分的含量应线性不相关，所测得吸光度值0.1~1为宜。具体步骤为：分别吸三种色素储备液若干毫升，加入5.0mL0.10mo1·L-的HC1，定容至50mL。每次标准溶液的吸取量填入表1。表1.标准溶液的组成(即C矩阵）样品号123456胭脂红日落黄柠檬黄2.模拟实验：吸收光谱通常用洛仑兹函数来模拟，当第j个组分存在时，吸光度的计算公式如下：kamfi(4)Au"1+bj6,-2F=fa式中入o,j：第j组分的最大吸收波长：第i个波长：Ai:波长为入o时的吸光系数，即最大吸光系数：kmax,j :第j个组分的含量（g/L）；cj:bj:调节峰宽的参数：b值越大，峰越窄。当三组分同时存在时，则有：(5)Ae为测量误差。产生Ae的方法如下：2.1随机误差法：Ag=(0.5-random)XDRandom为0~1间的随机数，D为吸光度的随机波动范围，取D=0.004较合适。2.2MontoCarlo法：Ag =0A-2, cns(2m)II、r2为0~1间的随机数。该方法获得的误差符合正态分布N(0，c2），标准差oA取0.002~0.003较合适。2.3真实误差法：在（2)法的基础上，考虑到吸光度A的标准偏差随A的增大而增大，但透光率的标准差一般为常数，两者关系为0.434010.4340,OATexP(-2.30A)可取0T=0.002。根据以上方法，可获得标准样本集和未知样本集的吸光度矩阵。五、数据处理根据原理部分提出的数据处理方法，用自已擅长的计算机语言编程，求出K矩阵并预报未知样
四. 实验部分 1.混合色素的测定 要求同学根据下列提示，自己设计实验步骤，并测定三份未知混合样。 1.1 测定食用色素的吸光度，必须控制pH值，建议控制酸度为 CHCl=0.01mol L -1(pH=2.0)。 1.2 在酸性条件下，三种色素的最大吸收波长和吸光系数的参考值如下： 胭脂红 日落黄 柠檬黄 λmax/nm 510 480 400 K/(L g -1 cm-1) 20 31 33 1.3 标准溶液建议配制6份。每份溶液中各组分的含量应线性不相关，所测得吸光度值0.1~1为宜。具体步骤为：分别吸三种色素储 备液若干毫升，加入5.0mL 0.10 mol L -1的HCl，定容至50mL。每次标准溶液的吸取量填入表1。 表1. 标准溶液的组成(即C矩阵) 样品号 1 2 3 4 5 6 胭脂红 日落黄 柠檬黄 2. 模拟实验： 吸收光谱通常用洛仑兹函数来模拟，当第j个组分存在时，吸光度的计算公式如下： (4) 式中λ0,j ： 第j组分的最大吸收波长； λi ： 第i 个波长； kmax,j ： 波长为λ0时的吸光系数，即最大吸光系数； cj： 第j个组分的含量(g/L); bj： 调节峰宽的参数；b值越大，峰越窄。 当三组分同时存在时，则有： (5) AE为测量误差。产生AE的方法如下： 2.1 随机误差法：AE=(0.5-random)×D Random 为0~1间的随机数，D为吸光度的随机波动范围，取D=0.004较合适。 2.2 Monto Carlo法： r1、r2为0~1间的随机数。该方法获得的误差符合正态分布N(0,σ2 )，标准差σA取0.002~0.003较合适。 2.3 真实误差法：在(2)法的基础上，考虑到吸光度A的标准偏差随A的增大而增大，但透光率的标准差一般为常数，两者关系为 可取σT=0.002。根据以上方法，可获得标准样本集和未知样本集的吸光度矩阵。 五. 数据处理 根据原理部分提出的数据处理方法，用自己擅长的计算机语言编程，求出K矩阵并预报未知样