生物化学:蛋白质化学 山农大生物化学与分子生物学系 第6页共20页 苯丙A最大光吸收在259mm、酪AA在278mm、色AA在279mm,蛋白质一般都 含有这三种AA残基,所以其最大光吸收在大约280nm波长处,因此能利用分光光度 法很方便的测定蛋白质的含量。分光光度法测定蛋白质含量的依据是朗伯一比尔定 律。在280nm处蛋白质溶液吸光值与其浓度成正比。 (三)酸碱性质 1、两性解离与等电点 氨基酸在水溶液或结晶内基本上均以兼性离子或偶极离子的形式存在。所谓两 性离子是指在同一个AA分子上带有能释放出质子的NH3正离子和能接受质子的 COO负离子,因此氨基酸是两性电解质 以甘氨酸为例:(一个NH3一个COO为例看解离状况:当两性离子溶解于水时,其 正负离子都能解离,但解离度与溶液的PH有关,向AA溶液加酸时,其两性离子 的羧基负离子接受质子,自身成为正离子,加入碱时,其两性离子的氨基正离子解 离出质子,自身成为负离子。 +K1 H2N-CH 2-C00 H3N+-CH 2-C00 H3N+-CH 2-C0OH 阴离子(R) 兼性离子(R*) 阳离子(R+) 氨基酸的等电点:氨基酸的带电状况取决于所处环境的PH值,改变PH值可以 使氨基酸带正电荷或负电荷,也可使它处于正负电荷数相等,即净电荷为零的两性 离子状态。使氨基酸所带正负电荷数相等即净电荷为零时的溶液P值称为该AA的 等电点。PH<PIAA负电荷 A正电荷 2、解离常数 解离式中K1和K2分别代表α一碳原子上-000H和-NH的表现解离常数。在生 化上,解离常数是在特定条件下(一定溶液浓度和离子强度)测定的。等电点的计 算可由其分子上解离基团的表观解离常数来确定。根据质量作用定律: 「R±1 KI [R]= RH IR KI [R] K2[
生物化学: 蛋白质化学 山农大生物化学与分子生物学系 第 6 页 共 20 页 6 苯丙 AA 最大光吸收在 259nm、酪 AA 在 278nm、色 AA 在 279nm，蛋白质一般都 含有这三种 AA 残基，所以其最大光吸收在大约 280nm 波长处，因此能利用分光光度 法很方便的测定蛋白质的含量。分光光度法测定蛋白质含量的依据是朗伯—比尔定 律。在 280nm 处蛋白质溶液吸光值与其浓度成正比。 （三）酸碱性质 1、两性解离与等电点 氨基酸在水溶液或结晶内基本上均以兼性离子或偶极离子的形式存在。所谓两 性离子是指在同一个 AA 分子上带有能释放出质子的 NH3 + 正离子和能接受质子的 COO- 负离子，因此氨基酸是两性电解质。 以甘氨酸为例：（一个 NH3 + 一个 COO- 为例看解离状况：当两性离子溶解于水时，其 正负离子都能解离，但解离度与溶液的 PH 有关，向 AA 溶液加酸时，其两性离子 的羧基负离子接受质子，自身成为正离子，加入碱时，其两性离子的氨基正离子解 离出质子，自身成为负离子。 氨基酸的等电点：氨基酸的带电状况取决于所处环境的 PH 值，改变 PH 值可以 使氨基酸带正电荷或负电荷，也可使它处于正负电荷数相等，即净电荷为零的两性 离子状态。使氨基酸所带正负电荷数相等即净电荷为零时的溶液 PH 值称为该 AA 的 等电点。PH<PI AA 负电荷 PH=PI AA 0 PH>PI AA 正电荷 2、解离常数 解离式中 K1 ′ 和Ｋ２ ′ 分别代表α－碳原子上-COOH 和-NH3 + 的表现解离常数。在生 化上，解离常数是在特定条件下（一定溶液浓度和离子强度）测定的。等电点的计 算可由其分子上解离基团的表观解离常数来确定。根据质量作用定律： 阴离子（R—） 兼性离子（R±） 阳离子（R+ ） H 3 N + - C H 2 - C O O H K 1 H + ' H 3 N + - C H 2 - C O O - ' H + H + K 2 H 2 N - C H 2 - C O O - H + / / 1 [ ][ ] [ ] [ ] [ ] 1 K R H R R R K ± + = + + ± = • + ± = − ± − + = • H K R R R R H K 2 [ ] [ ] [ ] [ ][ ] 1 / /
生物化学:蛋白质化学 山农大生物化学与分子生物学系 第7页共20页 因为等电点时,[R’]=[R] 所以 IR JH K2IR] H+ [H]=K1′ ·K9 方程两边求负对数 则 H K1+pK2 因为等电点时p=pI 所以 pI=-(pkI+pK2) 可以由手册查得各种AA的pK和pK,代入上式即得AA的等电点 3、多氨基(碱性氨基酸)和多羧基(酸性氨基酸)氨基酸的解离 解离原则:先解离a-C00H,随后其他-COOH;然后解离a-NH,随后其他-NH 总之羧基解离度大于氨基,α-C上基团大于非α-C上同一基团的解离度。 等电点的计算:首先写出解离方程,两性离子左右两端的表观解离常数的对数的算 术平均值。一般PI值等于两个相近RK值之和的一半。 如天冬氨酸 赖氨酸 4、氨基酸的酸碱滴定曲线 以甘氨酸为例,滴定曲线P33 1摩尔甘氨酸溶于水时,溶液PH为5.97,分别用标准NaOH和HCL滴定,以溶 液PH值为纵坐标,加入HCL和NaOH的摩尔数为横坐标作图,得到滴定曲线。该曲 线一个十分重要的特点就是在PH=2.34和PH=9.60处有两个拐点,分别为其PK和 PK。 规律:pH<pK1时,[R']>[R>[R] pB>pK2时,[R]>[R]>[R+]; pHpI时,净电荷为零,[R’]=[R] pKpI时,净电荷为“+”; p>pI时,净电荷为“ 7
生物化学: 蛋白质化学 山农大生物化学与分子生物学系 第 7 页 共 20 页 7 因为等电点时，[R+ ]=[R- ] 所以 [H+ ]2 =K1ˊ·K2ˊ 方程两边求负对数 则 因为等电点时 pH = pI 所以 可以由手册查得各种 AA 的 pK 和 pK，代入上式即得 AA 的等电点。 3、多氨基（碱性氨基酸）和多羧基（酸性氨基酸）氨基酸的解离 解离原则：先解离α-COOH，随后其他-COOH；然后解离α-NH3 + ，随后其他-NH3 + 总之羧基解离度大于氨基，α-C 上基团大于非α-C 上同一基团的解离度。 等电点的计算：首先写出解离方程，两性离子左右两端的表观解离常数的对数的算 术平均值。一般 PI 值等于两个相近 PK 值之和的一半。 如天冬氨酸 赖氨酸 4、氨基酸的酸碱滴定曲线 以甘氨酸为例，滴定曲线 P33 1 摩尔甘氨酸溶于水时，溶液 PH 为 5.97，分别用标准 NaOH 和 HCL 滴定，以溶 液 PH 值为纵坐标，加入 HCL 和 NaOH 的摩尔数为横坐标作图，得到滴定曲线。该曲 线一个十分重要的特点就是在 PH=2.34 和 PH=9.60 处有两个拐点，分别为其 PK 和 PK。 规律：pH<pK1 ′ 时,[R+ ]>[R± ]>[R- ]; pH>pK2 ′ 时，[R- ]>[R±]>[R+]; pH=pI 时，净电荷为零，[R+ ]=[R- ]; pH<pI 时，净电荷为“+”； pH>pI 时，净电荷为“-”。 + ± + ± = H K R K R H 2 [ ] 1 [ ][ ] / / ( 1 2 ) 2 1 / / pH = pK + pK ( 1 2 ) 2 1 / / pI = pK + pK