RNA,2ul5×甲醛胶电泳缓冲液,35ul 37%甲醛,10u甲酰胺,离心混匀,65℃ 变性15min后,迅速置冰浴中;再加入 2山lRNA上样缓冲液,离心混匀后上样 6Vcm电压,电泳1~2h;暗室内紫外 光下观察,拍照;如果观察到清晰的 18S、28SRNA电泳带,无大量小分子 RNA,说明RNA无明显降解,样品 70℃保存备用。 随着科技的发展,也有许多新型 纯化方法,使用试剂盒即可简单的 成分离纯化步骤,如使用纤维素柱纯 化mRNA 使用 Oligo(dn-纤维素层析法提取 poly (A)+RNA Poly(A)-O ligo(dn) 100mM NaCl AIRNA 1mM EDTA 鲜编景搞纯化Poly()mE删圆[ Poly(A)mRNA 1.3.1.2蛋白质的分离、纯化 蛋白质的分离纯化方法很多 根据蛋白质溶解度不同,有 1、盐析法 中性盐对蛋白质的溶解度有显著 影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升
RNA，2ul 5×甲醛胶电泳缓冲液，3.5μl 37%甲醛，10ul 甲酰胺，离心混匀，65℃ 变性 15min 后，迅速置冰浴中；再加入 2μl RNA 上样缓冲液，离心混匀后上样， 6V/cm 电压，电泳 1～2h；暗室内紫外 光下观察，拍照；如果观察到清晰的 18S、28S RNA 电泳带，无大量小分子 RNA，说明 RNA 无明显降解，样品－ 70℃保存备用。 随着科技的发展，也有许多新型 纯化方法，使用试剂盒即可简单的完 成分离纯化步骤，如使用纤维素柱纯 化 mRNA： 使用 Poligo(dT)-纤维素层析法提取 poly(A)+RNA TTTTTT TTTTTT TTTTTT TTTTTT AAAAA AAAAA Oligo(dT) 纤维素 Poly(A)--Oligo(dT) 100mM NaCl 洗脱 10mM Tris rRNA/tRNA 1mM EDTA Poly(A)mRNA Total RNA 纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图 1.3.1.2 蛋白质的分离、纯化 蛋白质的分离纯化方法很多： 根据蛋白质溶解度不同，有 1、盐析法 中性盐对蛋白质的溶解度有显著 影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升
高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶 当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度 不同程度下降并先后析出,这种现象称 盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高 浓度的盐离子可夺取蛋白质分子的水 化层,使蛋白质胶粒凝结并沉淀析出 盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效 果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大 小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓 度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液 中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段 沉淀。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的 静电斥力最小,因而溶解度也最小,各 种蛋白质的等电点有差别,可利用调节 溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使 之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐 析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂,甲醇 乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降 低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋 白质较易变性,应在低温下进行。 根据蛋白质分子大小的差别,有 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小 不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力,强 使水和其他小的溶质分子通过半透膜 而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的 滤膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析, 这是根据分子大小分离蛋白质混合物 最有效的方法之一。柱中最常用的填充
高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶； 当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度 不同程度下降并先后析出，这种现象称 盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高 浓度的盐离子可夺取蛋白质分子的水 化层，使蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。 盐析时若溶液 pH 在蛋白质等电点则效 果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大 小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓 度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液 中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段 沉淀。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的 静电斥力最小，因而溶解度也最小，各 种蛋白质的等电点有差别，可利用调节 溶液的 pH 达到某一蛋白质的等电点使 之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐 析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇， 乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降 低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋 白质较易变性，应在低温下进行。 根据蛋白质分子大小的差别，有 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小 不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强 使水和其他小的溶质分子通过半透膜， 而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的 滤膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析， 这是根据分子大小分离蛋白质混合物 最有效的方法之一。柱中最常用的填充
材料是葡萄糖凝胶( Sephadex ged)和 琼脂糖凝胶( agarose gel) 根据蛋白质带电性质不同,有 1、电泳法 各种蛋白质在同一pH条件下,因 分子量和电荷数量不同而在电场中的 迁移率不同而得以分开。值得重视的是 等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解 质作为载体,电泳时两性电解质形成 个由正极到负极逐渐增加的pH梯度 当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时 到达各自等电点的pH位置就停止,此 法可用于分析和制备各种蛋白质。 2、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂和阴 离子交换剂,当被分离的蛋白质溶液流 经离子交换层析柱时,带有与离子交换 剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交 换剂上,随后用改变pH或离子强度办 法将吸附的蛋白质洗脱下来。 根据配体特异性结合,有: 亲和层析法( aflinity chromatography)是分离蛋白质的一种 极为有效的方法,它经常只需经过一步 处理即可使某种待提纯的蛋白质从很 复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且 纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质 与另一种称为配体( Ligand)的分子能特 异而非共价地结合。其基本原理:蛋白 质在组织或细胞中是以复杂的混合物 形式存在,每种类型的细胞都含有上千 种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离 ( Separation),提纯( Purification)和 鉴定( Characterization)是生物化学中 的重要的一部分,至今还没的单独或 套现成的方法能移把任何一种蛋白质 从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此 往往采取几种方法联合使用
材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和 琼脂糖凝胶（agarose gel）。 根据蛋白质带电性质不同，有 1、电泳法 各种蛋白质在同一 pH 条件下，因 分子量和电荷数量不同而在电场中的 迁移率不同而得以分开。值得重视的是 等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解 质作为载体，电泳时两性电解质形成一 个由正极到负极逐渐增加的 pH 梯度， 当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时， 到达各自等电点的 pH 位置就停止，此 法可用于分析和制备各种蛋白质。 2、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂和阴 离子交换剂，当被分离的蛋白质溶液流 经离子交换层析柱时，带有与离子交换 剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交 换剂上，随后用改变 pH 或离子强度办 法将吸附的蛋白质洗脱下来。 根据配体特异性结合，有： 亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种 极为有效的方法，它经常只需经过一步 处理即可使某种待提纯的蛋白质从很 复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且 纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质 与另一种称为配体(Ligand）的分子能特 异而非共价地结合。其基本原理：蛋白 质在组织或细胞中是以复杂的混合物 形式存在，每种类型的细胞都含有上千 种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离 （Separation），提纯（Purification）和 鉴定（Characterization）是生物化学中 的重要的一部分，至今还没的单独或一 套现成的方法能移把任何一种蛋白质 从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此 往往采取几种方法联合使用
13.2限制酶及限制酶切反应 13.21限制酶的概念 许多细菌中都具有能识别DNA特 异位点的限制酶,其目的是使带有该特 异位点的外来DNA降解,以保持细菌 自身遗传物质的稳定,是细菌的一种自 我保护机制。然而现代分子生物学技术 则利用限制酶的特异识别与特异切割 特性,建立了重组DNA技术,使人类 基因的克隆、分离、基因的分析、诊断 成为可能 13.22限制酶的类型 I类和Ⅲ类限制酶 具有特异切割活 性,又具有修饰作用 前者需要ATP 它们所切割的部位 往往远离识别部位 Ⅱ类限制酶 它们往往没有修饰 作用 切割时也不需要 ATP提供能量 切割的部位往往与 识别部位相同或邻近 13.22.1类限制酶识别位点的 特点 常为4~6减基,且为迥文对 称( palindromes)(DNA的碱基组成在
1.3.2 限制酶及限制酶切反应 1.3.2.1 限制酶的概念 许多细菌中都具有能识别 DNA 特 异位点的限制酶，其目的是使带有该特 异位点的外来 DNA 降解，以保持细菌 自身遗传物质的稳定，是细菌的一种自 我保护机制。然而现代分子生物学技术 则利用限制酶的特异识别与特异切割 特性，建立了重组 DNA 技术，使人类 基因的克隆、分离、基因的分析、诊断 成为可能。 1.3.2.2 限制酶的类型 Ⅰ类和Ⅲ类限制酶 具有特异切割活 性，又具有修饰作用 前者需要 ATP 它们所切割的部位 往往远离识别部位 Ⅱ类限制酶 它们往往没有修饰 作用 切割时也不需要 ATP 提供能量 切割的部位往往与 识别部位相同或邻近 1.3.2.2.1 Ⅱ类限制酶识别位点的 特点 常为 4~6 减基，且为迥文对 称(palindromes) (DNA 的碱基组成在
双链中,从5→3是相同的),包括四种 类型:①迥文对称;②间隔迥文对称 ( interrupted palindromes),如HnfI、 XmnI:③兼并迥文对称,如 EcoR II HincⅡ,即迥文序列中有个别碱基可有 变化:④非迥文对称,如MboⅡ。 13.222Ⅲ类限制酶的命名原则 般而言,限制酶的名称由 3-4个字母组成,罗马数字表示该酶在 同类酶中的发现次序 13.223类限制酶的部分常用 酶 部分常用限制酶 酶 识别位点·切割位点5→3缓冲液 Aat II GACGT·C Ava I C· YCGRG KLLL Ava ll Bgl I (Msc D) IGG·CCA O(L) Bam h G· ATCC Bgl ll A· GATTI M Bcl I I· GATCA L Bsp1061(Clal) AT·CGAT M(O) Eco RI G· AALTO EcoRII (BstNI) CC(A/TGG M(L GTY·RAC Hind ll A· AGCTI Hinf I ANTC Hpa I GTT·AAC Kpn I GGTAO·C LMLLLoo Mbo ll GAAGANNNNNNN CTTCINNNNNNN GATC Msp I (Hpa II) C·CGG Not i GC· GGCCGO uML CGAT·CG Pyu ll
双链中，从 5’→3’是相同的)，包括四种 类型：① 迥文对称；② 间隔迥文对称 (interrupted palindromes)，如 HinfⅠ、 XmnⅠ；③ 兼并迥文对称，如 EcoRⅡ、 HincⅡ，即迥文序列中有个别碱基可有 变化；④ 非迥文对称，如 MboⅡ。 1.3.2.2.2 Ⅱ类限制酶的命名原则 一般而言，限制酶的名称由 3~4 个字母组成，罗马数字表示该酶在 同类酶中的发现次序 1.3.2.2.3 Ⅱ类限制酶的部分常用 酶 部分常用限制酶： 酶 识别位点·切割位点 5’→3’ 缓 冲 液 Aat II GACGT·C K Alu I AG·CT L Ava I C·YCGRG L Ava II G·G(A/T)CC L Bgl I (Msc I)1 TGG·CCA O(L) Bam HI G·GATCC M Bgl II A·GATCT M Bcl I T·GATCA L Bsp106I (ClaI)1 AT·CGAT M(O) Eco RI G·AATTC M EcoRII (BstNI)1 ·CC(A/T)GG M(L) Hae III GG·CC L Hinc II GTY·RAC L(M) Hind III A·AGCTT L Hinf I G·ANTC L Hpa I GTT·AAC L Kpn I GGTAC·C O Mbo II GAAGANNNNNNN· O CTTCTNNNNNNN· Mbo I (Sau3A)1 ·GATC L(L) Msp I (Hpa II)1 C·CGG O(O) Not I GC·GGCCGC M Pst I CTGCA·G L Pvu I CGAT·CG M Pvu II CAG·CTG M Rsa I CT·AC O Sac I (Sst I)1 GAGCT·C O(L)