1.限制与修饰系统（restrictionmodification）最好选择R，M或R、M的突变体菌株。限制：区别自已与非已的DNA，对外源的DNA产生限制作用，从而降解外源DNA。修饰：对自已的DNA加以修饰，使其不因限制作用而降解。在限制修饰系统中，限制与修饰作用分别借助于限制性内切酶和修饰甲基化酶来完成。例如：原始菌中是R+、M的大肠杆菌，可改造成为：R'、M与R'、M。用RM作受体菌，可提高转化效率103，但通常情况下，RM这一类受体菌用得较多。当然对于R、M的受体，也不是不可以做，只不过是转化效率较低，对于转化难度高的克隆或做基因文库要求99%基因进库，一般要10/μg，若转化效率为103-4，要有100～1000μg的DNA量，还不如提高转化效率100～1000有意义。2.重组系统（Recombination）外源DNA的分子与受体染色体DNA发生重组的机率很少，特别是recA"的菌株仅约10~，这种机率对转化效率（10°）来讲是微不足道的，而且rec*的菌株做受体菌往往比rec的菌株做受体菌转化效率要高得多（这可能是rec菌株的生理条件较难以控制，因此人们喜欢选用rec*的菌株做起始转化)；但是一旦这种极少数机率给碰上了，也就是说外源DNA和受体染色体DNA发生了重组，这也是很麻烦的事情。所以为了安全起见，人们往往在rec受体起始转化，筛选到正确的转化子后，又要把重组载体再转到rec受体菌中去保存。一般来讲：rect、rec的菌株培养物的光密度值也不同：例：rec(X1776)OD550=0.2(约75×107cell/mL)ODss=0.5(约5×107 cell /mL)rec(DHI)3.有明显的选择性差异有了明显的遗传表型差异，就便于重组子的检测。在大肠杆菌系统中，特别是质粒重组的DNA克隆技术，用得最多的是抗药性标记的选择，本实验就是应用了载体的Amp。在选择遗传性状差异的受体菌时，根据载体、供体特性，也有选择营养缺陷型，或特异性显色做为选择重组子的依据。但无论选择那一种遗传性状，有一点应该引起注意的是：回复突变频率高的受体菌，假阳性转化子的比率也较高，这在检测重组子的工作要特别注意。对于找不到合适的具有明显差异的受体菌的情况下，检测重组子可以通过快速抽提，酶切鉴定或菌落原位杂交等方法。4.选择能够发展感受态细胞的菌株做受体菌所谓感受态就是受体菌具有能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态。在细菌中能够发展感受态的细胞是很少的，一般认为占细菌总数的0.1%～1%，而且19
19 1. 限制与修饰系统(restriction—modification) 最好选择 R -，M +或 R -、M -的突变体菌株。 限制：区别自己与非己的 DNA，对外源的 DNA 产生限制作用，从而降解外源 DNA。 修饰；对自己的 DNA 加以修饰，使其不因限制作用而降解。 在限制修饰系统中，限制与修饰作用分别借助于限制性内切酶和修饰甲基化酶来完成。 例如：原始菌中是 R +、M -的大肠杆菌，可改造成为：R -、M -与 R -、M +。用 R -M +作受体菌， 可提高转化效率 103，但通常情况下，R -M -这一类受体菌用得较多。 当然对于 R +、M -的受体，也不是不可以做，只不过是转化效率较低，对于转化难度高的 克隆或做基因文库要求 99％基因进库，一般要 106 /μg，若转化效率为 103-4，要有 100～1000μg 的 DNA 量，还不如提高转化效率 100～1000 有意义。 2．重组系统(Recombination) 外源 DNA 的分子与受体染色体 DNA 发生重组的机率很少，特别是 recA-的菌株仅约 10-6， 这种机率对转化效率（106）来讲是微不足道的，而且 rec+的菌株做受体菌往往比 rec-的菌株 做受体菌转化效率要高得多（这可能是 rec-菌株的生理条件较难以控制，因此人们喜欢选用 rec+的菌株做起始转化）；但是一旦这种极少数机率给碰上了，也就是说外源 DNA 和受体染 色体 DNA 发生了重组，这也是很麻烦的事情。所以为了安全起见，人们往往在 rec+受体起始 转化，筛选到正确的转化子后，又要把重组载体再转到 rec -受体菌中去保存。 一般来讲：rec+、rec-的菌株培养物的光密度值也不同： 例：rec+ ( Xl776) OD550＝0.2(约 75×107 cell／mL) rec- (DHl) OD55＝0.5(约 5×107 cell／mL) 3．有明显的选择性差异 有了明显的遗传表型差异，就便于重组子的检测。在大肠杆菌系统中，特别是质粒重组 的 DNA 克隆技术，用得最多的是抗药性标记的选择，本实验就是应用了载体的 Ampr。在选 择遗传性状差异的受体菌时，根据载体、供体特性，也有选择营养缺陷型，或特异性显色做 为选择重组子的依据。但无论选择那一种遗传性状，有一点应该引起注意的是：回复突变频 率高的受体菌，假阳性转化子的比率也较高，这在检测重组子的工作要特别注意。 对于找不到合适的具有明显差异的受体菌的情况下，检测重组子可以通过快速抽提，酶 切鉴定或菌落原位杂交等方法。 4．选择能够发展感受态细胞的菌株做受体菌 所谓感受态就是受体菌具有能接受外源 DNA(周围环境中的 DNA 分子)能力的一种生理 状态。在细菌中能够发展感受态的细胞是很少的，一般认为占细菌总数的 0.1％～1％，而且
细菌发展感受态是在短暂时间内发展的，一般认为发展细菌的感受态是在生长对数期的后期，如：肺炎双球菌、枯草杆菌等。目前，CaCl2法是制备感受态细胞的常用方法。其原理是细菌处于0℃的低渗CaCl2溶液时，细胞膨胀，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA易于附着在细胞膜表面；经过42℃短时热击处理，促使细胞将外源DNA吸收。三、材料与仪器超净工作台，离心机，恒温摇床，恒温培养箱，恒温水浴器，EP管，培养血，玻璃涂棒，镊子，牙签，酒精灯，-20℃冰箱，高压蒸汽灭菌锅，pH计，电子天平及冰盒，制冰机。四、实验试剂大肠杆菌DH5α，BL21（DE3），连接产物，LB培养基；卡娜霉素（Kana），以无菌水配置成100mg/ml的溶液，过滤除菌后，-20℃保存备用0.1mol/LCaCl2溶液，121℃灭菌20min五、实验操作（一）制备新鲜的感受态细胞1.配置2~3个LB固体培养基（1gNaCl，0.5g酵母膏，1g蛋白陈，2g琼脂/100ml）200ml液体LB培养基。2.将DH5α划线接种到LB固体培养基中于37℃培养过夜。3.将LB培养基中的E.coli接种到2~3个5~10mlLB液体培养基中37℃，225rmp振荡过夜（16小时）。4.将LB液体培养基中抽取1ml过夜菌液接种到49mlLB液体培养基中，于37℃,225rmp振荡培养一小时。每15min取1ml菌液测一次OD600值，直到OD600值落在0.3~0.5之间。5.立刻将菌液置于冰浴10分钟。在无菌条件下将菌液转移置离心管，4℃，4000rmp离心5min，收集菌体。6.去除上清后，把菌体悬浮在20ml0.1mol/L预冷的CaCL溶液中，冰浴30分钟。4℃，4000rmp离心5min，收集菌体。7.再次去除上清液，把菌体再悬浮于1-2ml0.1mol/L预冷的CaCL中（重悬浮时操作要轻），置冰水浴上即成新鲜感受态细胞悬液。（二）转化反应为了检测转化是否成功，必须同时进行对照试验。1.取3支无菌Eppendorf管，分别加入以下各种成分：A.质粒DNA对照组：100uL0.1mol/LCaCl2溶液，2uLpET-28a。20
20 细菌发展感受态是在短暂时间内发展的，一般认为发展细菌的感受态是在生长对数期的后期， 如：肺炎双球菌、枯草杆菌等。目前，CaCl2法是制备感受态细胞的常用方法。其原理是细菌 处于 0℃的低渗 CaCl2溶液时，细胞膨胀，细胞膜的通透性发生改变，外源 DNA 易于附着在 细胞膜表面；经过 42℃短时热击处理，促使细胞将外源 DNA 吸收。 三、材料与仪器 超净工作台，离心机，恒温摇床，恒温培养箱，恒温水浴器，EP 管，培养皿，玻璃涂棒， 镊子，牙签，酒精灯，-20℃冰箱，高压蒸汽灭菌锅，pH 计，电子天平及冰盒，制冰机。 四、实验试剂 大肠杆菌 DH5α，BL21（DE3），连接产物， LB 培养基； 卡娜霉素(Kana)，以无菌水配置成 100mg/ml 的溶液，过滤除菌后，-20℃保存备用； 0.1 mol/L CaCl2 溶液，121℃灭菌 20min。 五、实验操作 （一）制备新鲜的感受态细胞 1. 配置 2~3 个 LB 固体培养基（1g NaCl，0.5g 酵母膏，1g 蛋白胨，2g 琼脂/100ml）、 200ml 液体 LB 培养基。 2. 将 DH5α 划线接种到 LB 固体培养基中于 37℃培养过夜。 3. 将 LB 培养基中的 E.coli 接种到 2~3 个 5~10ml LB 液体培养基中 37℃，225rmp 振荡 过夜（16 小时）。 4. 将 LB 液体培养基中抽取 1ml 过夜菌液接种到 49ml LB 液体培养基中，于 37℃，225rmp 振荡培养一小时。每 15min 取 1ml 菌液测一次 OD600 值，直到 OD600 值落在 0.3~0.5 之间。 5. 立刻将菌液置于冰浴 10 分钟。在无菌条件下将菌液转移置离心管，4℃，4000rmp 离 心 5min，收集菌体。 6. 去除上清后，把菌体悬浮在 20ml 0.1mol/L 预冷的 CaCL2 溶液中，冰浴 30 分钟。4℃， 4000rmp 离心 5min，收集菌体。 7. 再次去除上清液，把菌体再悬浮于 1-2ml 0.1mol/L 预冷的 CaCL2 中（重悬浮时操作要 轻），置冰水浴上即成新鲜感受态细胞悬液。 （二）转化反应 为了检测转化是否成功，必须同时进行对照试验。 1. 取 3 支无菌 Eppendorf 管，分别加入以下各种成分： A. 质粒 DNA 对照组：100μL 0.1 mol/L CaCl2溶液，2μL pET-28a
B.受体菌对照组：100μL感受态菌液，2uL无菌ddH20。C.正常连接组：100uL感受态菌液，10-20uL重组连接产物（来自实验三）。注意：Eppendorf管插入碎冰，或插入泡沫板内于冰水浴中，预冷5分钟；并将各连接液于65℃保温1015分钟，使T4DNA连接酶失活。2.轻弹、或轻轻旋转混匀各组内容物，冰浴30min，静置，勿动，确保DNA吸附在感受态细胞表面。3.将细菌放到42℃（双温度计测量）水浴锅中，热激90s（准确计时），使DNA分子通过细胞膜进入细胞内。4.迅速转入冰浴2min，使得感受态细胞膜收缩，磷脂双分子层运动关闭通道。5.加900uLLB液体培养基（在超净台中进行），轻轻混匀。6.37℃温育60min，130rpm慢摇（必须保证前20min的转速，因为大肠杆菌42min左右繁殖一代，第一代的细胞较脆弱，防止细胞破碎）。7.向预制的含有Amp的LB平板（Kana终浓度：100μg/ml）上添加200μL菌液，在超净台内静置直至液体被吸收；转移平板至培养箱中倒置培养过夜（12-16h）。8.次日，观察转化子菌落数，计算转化率。转化后，在含抗生素的平板上长出的菌落就是转化子，据此可计算转化子总数和转化效率。转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积转化频率（转化子数/每μg质粒DNA）=转化子总数/加入质粒DNA量(μg)注意事项：感受态细胞制备时注意OD600值。注意不要染菌。培养基制作时注意各个试剂的比例。接种时注意不要将培养基划破。严格控制转化每一步的时间以及温度。转化后接种于含有Amp抗生素的培养基上。六，思考题1，影响转化效率高低的因素都有什么？2.影响克隆载体的克隆能力的因素有哪些？21
21 B. 受体菌对照组：100μL 感受态菌液，2μL 无菌 ddH2O。 C. 正常连接组：100μL 感受态菌液，10-20μL 重组连接产物（来自实验三）。 注意：Eppendorf 管插入碎冰，或插入泡沫板内于冰水浴中，预冷 5 分钟；并将各连接液 于 65℃保温 10～15 分钟，使 T4DNA 连接酶失活。 2. 轻弹、或轻轻旋转混匀各组内容物，冰浴 30 min，静置，勿动，确保 DNA 吸附在感 受态细胞表面。 3. 将细菌放到 42 ℃ （双温度计测量）水浴锅中，热激 90s（准确计时），使 DNA 分子 通过细胞膜进入细胞内。 4. 迅速转入冰浴 2 min，使得感受态细胞膜收缩，磷脂双分子层运动关闭通道。 5. 加 900 μL LB 液体培养基（在超净台中进行），轻轻混匀。 6. 37 ℃ 温育 60 min ，130 rpm 慢摇（必须保证前 20 min 的转速，因为大肠杆菌 42 min 左右繁殖一代，第一代的细胞较脆弱，防止细胞破碎）。 7. 向预制的含有 Amp 的 LB 平板（Kana 终浓度：100g/ml）上添加 200μL 菌液，在超 净台内静置直至液体被吸收；转移平板至培养箱中倒置培养过夜（12-16h）。 8. 次日，观察转化子菌落数，计算转化率。 转化后，在含抗生素的平板上长出的菌落就是转化子，据此可计算转化子总数和转化效 率。 转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 转化频率（转化子数/每g 质粒 DNA）=转化子总数／加入质粒 DNA 量(g) 注意事项： 感受态细胞制备时注意 OD600 值。 注意不要染菌。 培养基制作时注意各个试剂的比例。 接种时注意不要将培养基划破。 严格控制转化每一步的时间以及温度。 转化后接种于含有 Amp 抗生素的培养基上。 六、思考题 1. 影响转化效率高低的因素都有什么？ 2. 影响克隆载体的克隆能力的因素有哪些？
实验五转化子DNA的快速提取一、实验的掌握常用的碱变性法提取质粒的方法。二、实验原理碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。三、材料与仪器高速离心机，超净工作台，旋转混合器，恒温摇床，恒温水浴锅，移液器，吸头，1.5ml离心管。四、实验试剂1.转化子大肠杆菌（大肠杆菌DH5α）。2.LB(LuriaBroth)液体培养基：0.5%胰蛋白陈、1%酵母浸出粉、0.5%NaCl，用2mol/LNaOH调节pH7.2~7.4,121℃灭菌20min。3.LB固体培养基：LB液体培养基加入2.0%的琼脂粉．121℃灭菌20min。4.用筛选的抗生素：氨苄青霉素（ampicillin，Amp)，配制成100mg/mL备用。5.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris-HCI（pH8.0）、10mmol/LEDTA(pH8.0)。121℃灭菌20min。使用时加入溶菌酶，终浓度为5mg/mL。6.溶液II：200mmol/LNaOH、1%SDS（溶液II应现用现配，常温下使用）。7.溶液III：3mol/LKAc(pH4.8)溶液。8.TE缓冲液：10mmol/LTris-HCI(pH8.0)、1mmol/LEDTA。9.预冷的无水乙醇。10.苯酚。11.氯仿：异戊醇(24:1)。22
22 实验五 转化子 DNA 的快速提取 一、实验目的 掌握常用的碱变性法提取质粒的方法。 二、实验原理 碱变性抽提质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离 目的。在 pH 高达 12．6 的碱性条件下，染色体 DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。 质粒 DNA 的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以 pH4．8 的 NaAc 高盐缓冲液去调节其 pH 至中性时，变性的质粒 DNA 又恢复原来的构型， 保存在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体 DNA 与 不稳定的大分子 RNA，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、材料与仪器 高速离心机，超净工作台，旋转混合器，恒温摇床，恒温水浴锅，移液器，吸头，1.5ml 离心管。 四、实验试剂 1. 转化子大肠杆菌（大肠杆菌 DH5α）。 2．LB (Luria Broth)液体培养基：0.5% 胰蛋白胨、1%酵母浸出粉、0.5% NaCl，用 2mol/L NaOH 调节 pH 7.2～7.4,121℃灭菌 20min。 3．LB 固体培养基：LB 液体培养基加入 2.0%的琼脂粉．121℃灭菌 20min。 4．用筛选的抗生素：氨苄青霉素( ampicillin，Amp)，配制成 l00mg/mL 备用。 5．溶液 I：50mmol/L 葡萄糖、25mmol/L Tris-HCI（pH 8.0）、l0mmol/L EDTA(pH 8.0)。 121℃灭菌 20min。使用时加入溶菌酶，终浓度为 5mg/mL。 6．溶液 II：200mmol/L NaOH、1% SDS（溶液 II 应现用现配，常温下使用）。 7．溶液 III：3mol/L KAc (pH4.8)溶液。 8. TE 缓冲液：l0mmol/L Tris-HCI(pH8.0)、1mmol/L EDTA。 9．预冷的无水乙醇。 10．苯酚。 11．氯仿：异戊醇(24:1)
五、实验操作1.在超净工作台中，从实验四的转化平板上挑选菌落（每组挑两个菌落），分别以灭菌枪头接种到含Amp的5mlLB液体培养基中（Amp终浓度：100ug/ml），37℃225rmp振荡过夜培养。2.取1ml菌液于1.5mlEppendorf管中，10000rpm离心30s，小心吸去上清。3.加入100叫l溶液I，在旋转混合器上振荡均匀。4.加入200μl溶液ⅡI，温和振荡，溶液变粘稠，并且变清亮透明，冰浴10min。5.加入150μl溶液IⅡⅢl，温和振荡，出现白色沉淀，冰浴10min。6.4℃，10000rpm离心10min，将上清液小心地转入另一个新的Eppendorf管中，加入等体积的苯酚：氯仿溶液（1：1，v/v），充分混匀，4℃，15000rpm离心10min，再将上清液转移至另一新离心管。7.向上清液中加入400μl氯仿溶液，混匀，10000rpm离心10min，将上清液转移至另一离心管。8.向上清液中加入400ul异内醇或2倍体积的乙醇，振荡混匀，-20℃放置10min。4℃15000rpm离心10min。弃去上清液，收集沉淀的核酸。9.用1mL75%预冷乙醇洗涤一次，弃去上清液，晾至管壁没有液体存留。10.加入20μLTE缓冲液溶解质粒DNA。六，思考题1．碱法质粒小提的原理是什么？2.提取效率的影响因素有哪些？3.如何尽可能提高提取率？23
23 五、实验操作 1. 在超净工作台中，从实验四的转化平板上挑选菌落（每组挑两个菌落），分别以灭菌 枪头接种到含 Amp 的 5ml LB 液体培养基中（Amp 终浓度：100g/ml），37℃ 225rmp 振荡 过夜培养。 2. 取 1ml 菌液于 1.5ml Eppendorf 管中，10000rpm 离心 30s，小心吸去上清。 3. 加入 100l 溶液 I，在旋转混合器上振荡均匀。 4. 加入 200l 溶液 II，温和振荡，溶液变粘稠，并且变清亮透明，冰浴 10min。 5. 加入 150l 溶液 III，温和振荡，出现白色沉淀，冰浴 10min。 6. 4℃，10000rpm 离心 10min，将上清液小心地转入另一个新的 Eppendorf 管中，加入等 体积的苯酚：氯仿溶液(1：1，v/v)，充分混匀，4℃，15000rpm 离心 10min，再将上清液转 移至另一新离心管。 7. 向上清液中加入 400l 氯仿溶液，混匀，10000rpm 离心 10min，将上清液转移至另一 离心管。 8. 向上清液中加入 400l 异丙醇或 2 倍体积的乙醇，振荡混匀，-20℃放置 10 min。4℃， 15000rpm 离心 10min。弃去上清液，收集沉淀的核酸。 9. 用 1 mL 75%预冷乙醇洗涤一次，弃去上清液，晾至管壁没有液体存留。 10. 加入 20L TE 缓冲液溶解质粒 DNA。 六、思考题 1. 碱法质粒小提的原理是什么？ 2. 提取效率的影响因素有哪些？ 3. 如何尽可能提高提取率？