II培养基的制备实验七培养基的制备一、目的要求了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法和步骤。二、基本原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。一般培养基中应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等，在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。另外，不同的微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异养微生物时，对一般细菌常用牛肉营蛋白陈培养基，对放线菌常用高氏1号培养基，培养酵母菌、霉菌则用麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基、马铃薯培养基（PDA），有时也常用马丁培养基分离霉菌。马丁培养基除含有霉菌所需的各种营养物质外，还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌，链霉菌可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基的酸碱度所带来不利的影响。三、实验材料牛肉膏、蛋白陈、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mo1/LNaOH、lmo1/LHCl、KNO3、NaCl、KzHPO4·3H20、MgSO·7H20、FeSO·7H20。试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等
II 培养基的制备 实验七 培养基的制备 一、目的要求 了解培养基的配制原理，掌握常用培养基的配制方法和步骤。 二、基本原理 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、 鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。一般培养基中应含有水分、碳源、氮源、能源、无 机盐、生长因素等，在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的 不同，所以培养基的种类很多。另外，不同的微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养 基的 pH 一般是偏酸的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和 嗜酸细菌例外）。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适 的范围。 由于微生物营养类型不同，应提供不同种类的培养基。在分离、培养异养微生物时，对 一般细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，对放线菌常用高氏 1 号培养基，培养酵母菌、霉菌则用 麦芽汁或豆芽汁葡萄糖培养基、马铃薯培养基（PDA），有时也常用马丁培养基分离霉菌。 马丁培养基除含有霉菌所需的各种营养物质外，还有孟加拉红染料，能抑制放线菌和细菌， 链霉菌可杀死或抑制细菌，但对霉菌均无害，所以这种培养基具有选择作用。 此外，由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培 养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗 养分和改变培养基的酸碱度所带来不利的影响。 三、实验材料 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号 笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等
四、实验方法与步骤（一）牛肉膏蛋白藤培养基的配制牛肉膏蛋白陈培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白陈10g，NaC15g，琼脂15～20g，水1000mL，pH7.4~7.61.称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉可放在小烧杯或表面血中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白陈极易吸潮，故称量时要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。2.加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，可将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5~2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。配培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。3.调pH检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1mo1/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mo1/LHCl进行调节。对于有些要求pH较精密的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。应注意PH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度，4.过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内（图7-1）。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基（指液体培养基中添加0.6-0.8%的琼脂)以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6.加棉塞
四、实验方法与步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl5g，琼脂 15～20g，水 1000mL，pH7.4～7.6 1．称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿 中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入水中，这时如稍微加 热，牛肉膏便会与称量纸分离，立即取出纸片。 蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取 一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。 2．加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药 品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，可将一定量的液体培养基分装于三 角瓶中，然后按 1.5∼2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌 和加热溶化同步进行，节省时间。 在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。配培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以 免离子进入培养基中，影响细菌生长。 3． 调 pH 检测培养基的 pH，若 pH 偏酸，可滴加 lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸检 测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用 lmol/L HCl 进行调节。对于有些要求 pH 较精密 的微生物，其 pH 的调节可用酸度计进行。 应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4．过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是 供一般使用的培养基，这步可省略。 5．分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内（图 7-1）。分装时可用漏斗以免 使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过 其容积的一半为宜。半固体培养基(指液体培养基中添加 0.6-0.8%的琼脂)以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 6．加棉塞
试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防正杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。7.包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。8.灭菌将上述培养基于121℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，需保存在冰箱中。9.摆斜面灭菌后，如制斜面，则需热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的1/2（图7-2）。10.无菌检查将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。X-图7-1.培养基的分装图7-2.斜面的放置（二）高氏1号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基，如果加入适量的抗菌药物，则可用来分离各种放线菌。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO1g，NaC10.5g，KHP0,3H00.5g，MgS0,·7H00.5g，FeS0,·7H00.01g，琼脂15~20g，水1000mL，pH7.4~7.6。1.称量和溶解先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeS04·7H20可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeS04·7H20，配成浓度为0.01g/mL的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备
试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度 要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总 长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用 8 层纱 布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7．包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若 培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然 后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。 8．灭菌 将上述培养基于 121℃湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，需保存在冰箱中。 9．摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长 度不超过试管总长的 1/2（图 7-2）。 10．无菌检查 将灭菌的培养基放入 37℃温箱中培养 24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清 洁的橱内，备用。 图 7-1.培养基的分装 图 7-2.斜面的放置 （二）高氏 l 号培养基的配制 高氏 1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基，如果加入适量的抗菌药物，则 可用来分离各种放线菌。其配方如下： 可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂 15～20g，水 1000mL，pH7.4～7.6。 l．称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状， 再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次 溶解。对微量成分 FeSO4·7H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在 1000mL 中加 入 1g 的 FeSO4·7H2O，配成浓度为 0.01g/mL 的贮备液，再在 1000mL 培养基中加入以上贮备
液1m即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉蛋白陈培养基配制。2.pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基配制。（三）PDA培养基的配制马铃薯培养基（PDA）常用于霉菌或酵母菌培养。马铃薯（去皮）200g，煎糖（或葡萄糖）20g，水1000mL，配制方法如下：将马铃薯去皮，切成约2cm的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，再补足至1000mL，自然pH。霉菌用蔗糖，酵母菌用葡萄糖。分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基。（四）麦芽汁培养基的配制麦芽汁培养基是天然的培养基，它所含的营养物质丰富，是培养真菌的良好基质。这种培养基的制作包含有淀粉的糖化过程，即用麦芽中的淀粉酶来水解淀粉，使淀粉降解成小分子的葡萄糖、麦芽糖和其他寡糖，以利于微生物吸收利用。其配制方法如下：1.将干大麦芽粉碎成大麦芽粉（越细越好，干的大麦芽可向当地啤酒厂购买，亦可自己用大麦催芽后于3545℃烘干即成）。2.取大麦芽粉1Kg加水3L（用铝锅装），置60℃水浴中保持糖化直到无淀粉反应为止（检查方法是取糖化液0.5mL加碘液2滴，如无蓝紫色出现，即可停止糖化）。3.将糖化液加2～3个鸡蛋清（有助于麦芽汁澄清）搅拌均匀，让其自然沉淀，用两层纱布过滤，将滤液煮沸后再过滤一次，取滤液备用。4.将上述滤液加水稀释至10～15°BX（一种表示糖液浓度的比重单位，用糖锤度计测定）备用。5.若需配成固体培养基，则取上述稀释液加2%的琼脂煮沸，待琼脂完全融化后再分装入所需的容器中。（五）马丁氏培养基的配制马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：KzHP01g，MgS04·7H200.5g，蛋白陈5g，葡萄糖10g，琼脂15～20g，水1000mL，自然pH。1.称量和溶解先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟加拉红溶液3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白陈培养基配制。2.分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基。3.链霉素的加入
液 1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其 琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2．pH 调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 （三）PDA 培养基的配制 马铃薯培养基(PDA)常用于霉菌或酵母菌培养。 马铃薯(去皮)200g, 蔗糖(或葡萄糖) 20g, 水 1000mL, 配制方法如下: 将马铃薯去皮, 切成约 2cm2 的小块,放入 1500mL 的烧杯中煮沸 30min, 注意用玻棒搅拌以防糊底, 然后用双 层纱布过滤, 取其滤液加糖,再补足至 1000mL, 自然 pH。 霉菌用蔗糖, 酵母菌用葡萄糖。 分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基。 （四）麦芽汁培养基的配制 麦芽汁培养基是天然的培养基，它所含的营养物质丰富，是培养真菌的良好基质。这 种培养基的制作包含有淀粉的糖化过程，即用麦芽中的淀粉酶来水解淀粉，使淀粉降解成小 分子的葡萄糖、麦芽糖和其他寡糖，以利于微生物吸收利用。其配制方法如下： 1. 将干大麦芽粉碎成大麦芽粉（越细越好，干的大麦芽可向当地啤酒厂购买，亦可自己 用大麦催芽后于 35～45℃烘干即成）。 2. 取大麦芽粉 1Kg 加水 3L（用铝锅装），置 60℃水浴中保持糖化直到无淀粉反应为止 （检查方法是取糖化液 0.5mL 加碘液 2 滴，如无蓝紫色出现，即可停止糖化）。 3. 将糖化液加 2～3 个鸡蛋清（有助于麦芽汁澄清）搅拌均匀，让其自然沉淀，用两层 纱布过滤，将滤液煮沸后再过滤一次，取滤液备用。 4. 将上述滤液加水稀释至 10～15°BX（一种表示糖液浓度的比重单位，用糖锤度计测定） 备用。 5. 若需配成固体培养基，则取上述稀释液加 2%的琼脂煮沸，待琼脂完全融化后再分装入 所需的容器中。 （五）马丁氏培养基的配制 马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下： K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 l0g，琼脂 15～20g，水 1000mL，自 然 pH。 1．称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解 后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成 1%的水溶液，在 1000mL 培养液中加入以上孟 加拉红溶液 3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基。 3．链霉素的加入
链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液（配好的链霉素溶液保存于-20℃），在100mL培养基中加1%链霉素0.3mL，使每毫升培养基中合链霉素30μg。五、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。六、思考题1：配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么？2：培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基如何进行无菌检查？3。高氏培养基属何种培养基？除培养放线菌外，高氏培养基还能培养细菌和真菌吗？为什么？4。能直接用大麦粉制备麦芽汁培养基吗？麦芽粉糖化时为什么采用60℃？5.举例说明细菌、放线菌、酵母、霉菌通常使用哪些培养基？其pH值如何？
链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至 45℃左右时才能加入。 可先将链霉素配成 1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在 100mL 培养基中加 1%链霉 素 0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素 30μg。 五、实验报告 记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 六、思考题 l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基 如何进行无菌检查? 3． 高氏培养基属何种培养基？除培养放线菌外，高氏培养基还能培养细菌和真菌吗？为什 么？ 4． 能直接用大麦粉制备麦芽汁培养基吗？麦芽粉糖化时为什么采用 60℃？ 5. 举例说明细菌、放线菌、酵母、霉菌通常使用哪些培养基？其 pH 值如何？