四、实验方法与步骤 (一)牛肉青蛋白胨培养基的配制 牛肉音蛋白陈培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉音3g,蛋白陈10g,NaC15g,琼脂1520g,水1000mL,pH7.4~7.6 1.称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉育可放在小烧杯或表面皿 中称量，用热水溶解后倒入大烧杯：也可放在称量纸上称量，随后放入水中，这时如稍微加 热，牛肉膏便会与称量纸分离，立即取出纸片。 蛋白陈极岛吸潮，妆称量时要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取 一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。 2.加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药 品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，可将一定量的液体培养基分装于三 角瓶中，然后按1.52.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭茵 和加热溶化同步进行，节省时间。 在脂溶化过程中，不断并，以防凉脂搬底或溢出。配培养基时，不可用铜或铁锅加熟化，以 免离子进入培养基中，影响细曹生长。 3.调H 检测培养基的pH,若pH偏酸，可滴加1ol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸检 测，直至达到所需H范用。若偏碱，则用1ol/LHC1进行调节。对于有些要求pH较精密 的微生物，其州的调节可用酸度计进行。 应注意咀值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是 供一般使用的培养基，这步可省略。 5.分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内（图7-1）。分装时可用渐斗以免 使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：園圆体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过 其容积的一半为宜。半固体培养基（指液体培养基中添加0.6-0.8%的琼脂）以试管高度的1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 6.加棉塞
四、实验方法与步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下： 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl5g，琼脂 15～20g，水 1000mL，pH7.4～7.6 1．称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿 中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入水中，这时如稍微加 热，牛肉膏便会与称量纸分离，立即取出纸片。 蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取 一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。 2．加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药 品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，可将一定量的液体培养基分装于三 角瓶中，然后按 1.5∼2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌 和加热溶化同步进行，节省时间。 在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。配培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以 免离子进入培养基中，影响细菌生长。 3． 调 pH 检测培养基的 pH，若 pH 偏酸，可滴加 lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸检 测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用 lmol/L HCl 进行调节。对于有些要求 pH 较精密 的微生物，其 pH 的调节可用酸度计进行。 应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4．过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用 4 层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是 供一般使用的培养基，这步可省略。 5．分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内（图 7-1）。分装时可用漏斗以免 使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过 其容积的一半为宜。半固体培养基(指液体培养基中添加 0.6-0.8%的琼脂)以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。 6．加棉塞
试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度 要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总 长约3/5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱 布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7.包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若 培养基分装于试管中，则应以5支或7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然 后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。 8.灭南 将上述培养基于121℃湿热灭菌20mi。如因特殊情况不能及时灭菌，需保存在冰箱中。 9.摆斜面 灭茵后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长 度不超过试管总长的1/2（图7-2） 10.无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24一48趾，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清 洁的橱内，备用。 图7-1.培养基的分装 图7-2.斜面的放置 (二)高氏1号培养基的配制 高氏1号培养基是用于分离和培养放线南的合成培养基，如果加入适量的抗菌药物，则 可用来分离各种放线菌。其配方如下： 可溶性淀粉20g,KN01g,NaC10.5g,KHP0,·3H00.5g,MgS0,·700.5g,FeS0,·7H0 0.01g,球脂15~20g,水1000mL,p7.4~7.6。 1.称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状， 再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次 溶解。对微量成分FeS0·7H0可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在1000mL中加 入1g的FeS04·7H0,配成浓度为0.01g/L的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备
试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度 要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总 长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用 8 层纱 布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7．包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若 培养基分装于试管中，则应以 5 支或 7 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然 后用记号笔注明、培养基名称、组别、日期。 8．灭菌 将上述培养基于 121℃湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，需保存在冰箱中。 9．摆斜面 灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长 度不超过试管总长的 1/2（图 7-2）。 10．无菌检查 将灭菌的培养基放入 37℃温箱中培养 24～48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清 洁的橱内，备用。 图 7-1.培养基的分装 图 7-2.斜面的放置 （二）高氏 l 号培养基的配制 高氏 1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基，如果加入适量的抗菌药物，则 可用来分离各种放线菌。其配方如下： 可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂 15～20g，水 1000mL，pH7.4～7.6。 l．称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状， 再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次 溶解。对微量成分 FeSO4·7H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在 1000mL 中加 入 1g 的 FeSO4·7H2O，配成浓度为 0.01g/mL 的贮备液，再在 1000mL 培养基中加入以上贮备
液1L即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其 琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2.pH调节、分装、包扎及无菌检查同牛肉音蛋白胨培养基配制。 (三)PDA培养基的配制 马铃薯培养基(PDA)常用于霉菌或酵母菌培养。 马铃薯（去皮）200g,蔗糖（或葡萄糖）20g,水1000mL,配制方法如下：将马铃薯去皮， 切成约2cm的小块，放入1500aL的烧杯中煮沸30min,注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双 层纱布过滤，取其滤液加糖，再补足至1000mL,自然pH。霉南用旅糖，酵母南用葡萄糖。 分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基。 (四)麦芽汁培养基的配制 麦芽汁培养基是天然的培养基，它所含的营养物质丰富，是培养真茵的良好基质。这 种培养基的制作包含有淀粉的糖化过程，即用麦芽中的淀粉酶来水解淀粉，使淀粉降解成小 分子的葡萄糖、麦芽糖和其他寡糖，以利于微生物吸收利用。其配制方法如下： 1.将干大麦芽粉碎成大麦芽粉（越细越好，干的大麦芽可向当地啤酒厂购买，亦可自己 用大麦催芽后于35一45℃烘千即成)。 2.取大麦芽粉1Kg加水3L(用铝锅装)，置60℃水浴中保持糖化直到无淀粉反应为止 (检查方法是取糖化液0.5L加碘液2滴，如无蓝紫色出现，即可停止糖化)。 3.将糖化液加2一3个鸡蛋清（有助于麦芽汁澄清）搅拌均匀，让其自然沉淀，用两层 纱布过滤，将滤液煮沸后再过滤一次，取滤液备用。 4.将上述滤液加水稀释至10~15°BX(一种表示糖液浓度的比重单位，用糖锤度计测定) 备用。 5.若需配成周体培养基，则取上述稀释液加2%的琼脂煮沸，待琼脂完全融化后再分装入 所需的容器中。 (五)马丁氏培养基的配制 马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下： KHP0,1g,MgS0:·7L00.5g,蛋白胨5g,葡萄糖10g,琼脂15一20g,水1000mL,自 然H。 1.称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解 后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入以上孟 加拉红溶液3.3L,混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白陈培养基配制。 2.分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基。 3.链霉素的加入
液 1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其 琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2．pH 调节、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 （三）PDA 培养基的配制 马铃薯培养基(PDA)常用于霉菌或酵母菌培养。 马铃薯(去皮)200g, 蔗糖(或葡萄糖) 20g, 水 1000mL, 配制方法如下: 将马铃薯去皮, 切成约 2cm2 的小块,放入 1500mL 的烧杯中煮沸 30min, 注意用玻棒搅拌以防糊底, 然后用双 层纱布过滤, 取其滤液加糖,再补足至 1000mL, 自然 pH。 霉菌用蔗糖, 酵母菌用葡萄糖。 分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基。 （四）麦芽汁培养基的配制 麦芽汁培养基是天然的培养基，它所含的营养物质丰富，是培养真菌的良好基质。这 种培养基的制作包含有淀粉的糖化过程，即用麦芽中的淀粉酶来水解淀粉，使淀粉降解成小 分子的葡萄糖、麦芽糖和其他寡糖，以利于微生物吸收利用。其配制方法如下： 1. 将干大麦芽粉碎成大麦芽粉（越细越好，干的大麦芽可向当地啤酒厂购买，亦可自己 用大麦催芽后于 35～45℃烘干即成）。 2. 取大麦芽粉 1Kg 加水 3L（用铝锅装），置 60℃水浴中保持糖化直到无淀粉反应为止 （检查方法是取糖化液 0.5mL 加碘液 2 滴，如无蓝紫色出现，即可停止糖化）。 3. 将糖化液加 2～3 个鸡蛋清（有助于麦芽汁澄清）搅拌均匀，让其自然沉淀，用两层 纱布过滤，将滤液煮沸后再过滤一次，取滤液备用。 4. 将上述滤液加水稀释至 10～15°BX（一种表示糖液浓度的比重单位，用糖锤度计测定） 备用。 5. 若需配成固体培养基，则取上述稀释液加 2%的琼脂煮沸，待琼脂完全融化后再分装入 所需的容器中。 （五）马丁氏培养基的配制 马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下： K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 l0g，琼脂 15～20g，水 1000mL，自 然 pH。 1．称量和溶解 先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解 后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成 1%的水溶液，在 1000mL 培养液中加入以上孟 加拉红溶液 3.3mL，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基。 3．链霉素的加入
链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。 可先将链霉素配成1%的溶液（配好的链霉素溶液保存于-20℃），在100mL培养基中加1%链霉 素0.3L,使每毫升培养基中合链霉素30μg。 五、实验报告 记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 六、思考题 1.配制培养基有哪几个步骤？在操作过程中应注意些什么问题？为什么？ 2。培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌？若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基 如何进行无菌检查？ 3。高氏培养基属何种培养基？除培养放线南外，高氏培养基还能培养细菊和真南吗？为什 么？ 4.能直接用大麦粉制备麦芽汁培养基吗？麦芽粉糖化时为什么采用60℃？ 5.举例说明细菌、放线菌、酵母、霉菌通常使用哪些培养基？其pH值如何？
链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至 45℃左右时才能加入。 可先将链霉素配成 1%的溶液(配好的链霉素溶液保存于-20℃)，在 100mL 培养基中加 1%链霉 素 0.3mL ，使每毫升培养基中合链霉素 30μg。 五、实验报告 记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 六、思考题 l．配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 2．培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基 如何进行无菌检查? 3． 高氏培养基属何种培养基？除培养放线菌外，高氏培养基还能培养细菌和真菌吗？为什 么？ 4． 能直接用大麦粉制备麦芽汁培养基吗？麦芽粉糖化时为什么采用 60℃？ 5. 举例说明细菌、放线菌、酵母、霉菌通常使用哪些培养基？其 pH 值如何？
III消毒与灭菌 消毒(disinfection)与灭南(sterilization)两者的意义有所不同。消毒一般是指 消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，灭南则是指杀灭一切微生物的营养体，芽孢和孢子。 在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作 场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒和灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和 使用化学药品等方法。 加热法分为干热灭菌和湿热灭菌两类。干热灭菌有火焰烧灼和热空气灭茵两种。湿热灭茵中 包括高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌法、煮沸消毒法和超高温杀菌。许多材料例如血清、抗生 素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，均会被破坏，因此采用过滤除菌的方法
III 消毒与灭菌 消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。消毒一般是指 消灭病原菌和有害微生物的营养体而言，灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体，芽孢和孢子。 在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作 场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒和灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和 使用化学药品等方法。 加热法分为干热灭菌和湿热灭菌两类。干热灭菌有火焰烧灼和热空气灭菌两种。湿热灭菌中 包括高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌法、煮沸消毒法和超高温杀菌。许多材料例如血清、抗生 素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，均会被破坏，因此采用过滤除菌的方法