实验须知 普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物 学的基本知识：加深理解课堂讲授的某些微生物理论。同时，通过实验：培养学生观察、思 考、分析问题、解决问题和提出问题的能力：养成事实求是、严肃认真的科学态度，以及敢 于创新的开拓精神：树立物俭节约、爱护公物的良好作风 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验目的、原理和方法，做到心 中有数，思路清晰。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记 下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇到盛茵试管或瓶不慎打 破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告知道教师，及时处理， 切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使用乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关 掉火源，在用湿布或沙土掩盖灭火。必要时使用灭火机。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力 求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有的仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如 有南液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖15h后擦去， 如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗 涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师制定的地点 进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真 回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.离开实验室前将手洗净，注意关闭火、煤气、门窗、灯等
实验须知 普通微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物 学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物理论。同时，通过实验；培养学生观察、思 考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成事实求是、严肃认真的科学态度，以及敢 于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的良好作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1. 每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验目的、原理和方法，做到心 中有数，思路清晰。 2. 认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记 下每次观察的现象和结果，以便分析。 3. 实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4. 实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇到盛菌试管或瓶不慎打 破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告知道教师，及时处理， 切勿隐瞒。 5. 实验过程中，切勿使用乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关 掉火源，在用湿布或沙土掩盖灭火。必要时使用灭火机。 6. 使用显微镜或其他贵重仪器时，要细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力 求节约，用毕后仍放回原处。 7. 每次实验完毕后，必须把所有的仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如 有菌液污染桌面或其他地方时，可用 3%来苏尔液或 5%石炭酸液覆盖 1.5h 后擦去， 如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗 涤前须浸泡在 3%来苏尔液中进行消毒。 8. 每次实验需进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师制定的地点 进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9. 每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，认真 回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10. 离开实验室前将手洗净，注意关闭火、煤气、门窗、灯等
目录 实验一 细菌的简单染色 9 实验二 细菌的革兰氏染色 .12 实验三 细菌的特殊染色· 4 实验四 酵母菌的形态观察 .17 实验五霉菌的形态观察 .19 实验六 徽生物大小的测定 .22 实验七培养基的制备 25 实验八 干热灭菌 31 实验九高压蒸汽灭菌 33 实验十紫外线灭菌。 .36 实验十一 微孔滤膜过滤除菌 38 实验十二 微生物接种技术 .…40 实验十三 微生物的分离与纯化 .47 实验十四微生物的培养特征 51 实验十五 厌氧微生物的培养 53 实验十六微生物血球计数板直接计数法 .58 实验十七 微生物的平板菌落计数法 …62 实验十八细菌生长曲线的测定 .65 实验十九土壤中放线菌的筛选及形态观察 68 附录1实验室意外事故的处理 .72 附录2实验器皿的清洗与包扎 .73 附录3实验用培养基的配制. 75 附录4酸碱指示剂的配制（按笔画顺序排列）… .79 附录5实验用染色液及试剂的配制. 80
目录 实验一 细菌的简单染色 ........................................................................9 实验二 细菌的革兰氏染色 ..................................................................12 实验三 细菌的特殊染色 ......................................................................14 实验四 酵母菌的形态观察 ..................................................................17 实验五 霉菌的形态观察 ......................................................................19 实验六 微生物大小的测定 ..................................................................22 实验七 培养基的制备 ..........................................................................25 实验八 干热灭菌 ..................................................................................31 实验九 高压蒸汽灭菌 ..........................................................................33 实验十 紫外线灭菌 ..............................................................................36 实验十一 微孔滤膜过滤除菌 ..............................................................38 实验十二 微生物接种技术 ..................................................................40 实验十三 微生物的分离与纯化..........................................................47 实验十四 微生物的培养特征 ..............................................................51 实验十五 厌氧微生物的培养 ..............................................................53 实验十六 微生物血球计数板直接计数法..........................................58 实验十七 微生物的平板菌落计数法..................................................62 实验十八 细菌生长曲线的测定..........................................................65 实验十九 土壤中放线菌的筛选及形态观察......................................68 附录 1 实验室意外事故的处理 ..............................................................72 附录 2 实验器皿的清洗与包扎 ..............................................................73 附录 3 实验用培养基的配制 ..................................................................75 附录 4 酸碱指示剂的配制(按笔画顺序排列) .......................................79 附录 5 实验用染色液及试剂的配制......................................................80
Ⅰ徽生物的染色与形态结构的观察 微生物由于个体微小，需借助普通光学显微镜、相差显微镜等设各来讲行观容，其中用相差 显微镜可以直接观察微生物的形态特征，但其应用有局限性：用电子显微镜可以观察到微生 物的各种形态结构，但因其价格昂责、设备条件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限 制。所以，一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而微生物 细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的 明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通显微镜观察细茵时 代先将细菌进行染物时 巴的 www.bbioo.com
I 微生物的染色与形态结构的观察 微生物由于个体微小，需借助普通光学显微镜、相差显微镜等设备来进行观察，其中用相差 显微镜可以直接观察微生物的形态特征，但其应用有局限性；用电子显微镜可以观察到微生 物的各种形态结构，但因其价格昂贵、设备条件要求高、操作也较复杂，应用上也受一定限 制。所以，一般实验室仍常用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察。然而微生物 细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的 明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通显微镜观察细菌时， 往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以清楚地观察到细菌的形状及某些细 胞结构。因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态 结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。 www.bbioo.com
实验一 细菌的简单染色 一、目的要求 1.掌握细菌简单染色法。 2.通过简单染色法比较细菌菌体细胞形态和排列方式。 二、基本原理： 细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体者色，与背景形成鲜明的对比，以便 在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等 常用碱性染料如美蓝、结晶紫等对细胞进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱 酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸 性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌接合 使细菌着色。经染色后的细茵细胞与背景形成鲜明对比，在显微镜下更易于识别。 三、实验材料 L.菌种：乳酸链球菌(streptococcus lactis)、大肠杆菌(Escherichia col)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、红螺旋菌(rhodospirillum sp.）. 2.染料：吕氏美蓝染液、草酸铵结品紫染液。 3.其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。 四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片+干燥→固定+染色+水洗 →干燥+镜检 ()涂片：用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或先滴 小满无商木于载酸片中央，用接种怀了运了引 从斜面上挑出少许，与载玻片上的水 滴混合均匀，涂成一薄层。 11简单染色的周定
实验一 细菌的简单染色 一、目的要求 1. 掌握细菌简单染色法。 2. 通过简单染色法比较细菌菌体细胞形态和排列方式。 二、基本原理： 细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便 在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。 常用碱性染料如美蓝、结晶紫等对细胞进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱 酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸 性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌接合 使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比，在显微镜下更易于识别。 三、实验材料 1. 菌种：乳酸链球菌（streptococcus lactis）、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、红螺旋菌（rhodospirillum sp.）。 2. 染料：吕氏美蓝染液、草酸铵结晶紫染液。 3. 其它：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、无菌水、擦镜纸等。 四、实验方法与步骤 操作过程如下： 涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检。 （1）涂片：用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或先滴一 小滴无菌水于载玻片中央，用接种环 从斜面上挑出少许，与载玻片上的水 滴混合均匀，涂成一薄层。 图 1-1 简单染色的固定
(2)干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠 近火焰。 (3)周定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速 来回移动34次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉 过烫为宜，放置待冷后染色（图11）。 固定的目的是： ①杀死微生物，固定其细胞结构： ②保证南体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉： ③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易者色。 (4)染色：滴加吕氏美蓝液（或其它染色液），覆盖玻片涂菌部份，染色1分钟。 (5)水洗：用木炭夹夹住玻片的一端，斜置玻片，用细小的缓水流自标本的上端流下， 洗去多余的染料，勿使水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水无色为止。 (6)干燥：将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水份，或微微加热，以加快 干燥速度。 (7)镜检。 油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高， 然后将油镜转到工作位置，在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜 筒小心的降下，使油镜侵在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈， 若使用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应该在聚光镜和载玻片之间也加滴香柏油，保证其 达到最大的效能。调解照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出 现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述禄作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升 太快，以至眼晴捕捉不到一闪而过的物象，通此情况，应重新操作。另外应特别注意不要 因在下降镜头时用力过难，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及我玻片， (8)显微镜用毕后的处理： ①上升镜筒，取下载玻片。 ②用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸越少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹， 然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦找镜头，以免使镜头沾 上污渍或产生划痕，形响观察。 ③用擦镜纸清洁其他物镜及目镜：用绸布清洁显微镜的金属部件。 ④将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，在向下旋。同时把聚 光镜降下，以免接触物镜与聚光镜发生碰撞危险， 五、实验报告
（2）干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠 近火焰。 （3）固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速 来回移动 3~4 次，共约 3~4 秒。要求玻片温度不超过 60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉 过烫为宜，放置待冷后染色（图 1-1）。 固定的目的是： ①杀死微生物，固定其细胞结构； ②保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。 （4）染色：滴加吕氏美蓝液（或其它染色液），覆盖玻片涂菌部份，染色 1 分钟。 （5）水洗：用木炭夹夹住玻片的一端，斜置玻片，用细小的缓水流自标本的上端流下， 洗去多余的染料，勿使水流直接冲洗涂菌处，直到流下的水无色为止。 （6）干燥：将标本置于桌上风干，也可用吸水纸轻轻地吸去水份，或微微加热，以加快 干燥速度。 （7）镜检。 油镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高， 然后将油镜转到工作位置，在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜 筒小心的降下，使油镜侵在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈， 若使用聚光器的数值孔径值超过 1.0，还应该在聚光镜和载玻片之间也加滴香柏油，保证其 达到最大的效能。调解照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出 现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。 有时按上述操作还找不到目的物，则可能是由于油镜头下降还未到位，或因油镜上升 太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物象，遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要 因在下降镜头时用力过猛，或调焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。 （8）显微镜用毕后的处理： ① 上升镜筒，取下载玻片。 ② 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯擦去镜头上残留的油迹， 然后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾 上污渍或产生划痕，影响观察。 ③ 用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。 ④ 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，在向下旋。同时把聚 光镜降下，以免接触物镜与聚光镜发生碰撞危险。 五、实验报告