Cycle 2 5′1 TTTTTTTTTTTTTT3 Denature and 5′ TTTTTTTTTTTT 535 anneal new primers 5′千TT3′ 3 5 Primer extension TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3 」⊥L 3 5 5 3 3 5′ 3 5 Cycles 3-25 for greater than a 10-fold increase in DNA
四、mRNA差别显示分离目的基因 根据表达特征,真核细胞的基因可以分为两类: 是所谓的看家基因( house- keeping gene),另 类是发育调控基因( developmental regulated gene 在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不 同阶段、在生物体对外界环境的压力的反应、在个 体的衰老与死亡等不同的环境下发育调控基因的表 达是不同的,这就是基因的差别表达( differential expression)。mRNA的差别显示技术就是用来分 离这些差别表达的基因的一项有用的技术。 该技术是 P LIang& AD Pardee1992年建立的,全 称为mRNA差别显示PCR( mRna differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR)
四、mRNA差别显示分离目的基因 根据表达特征，真核细胞的基因可以分为两类： 一是所谓的看家基因（house-keeping gene），另一 类是发育调控基因（developmental regulated gene）。 在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不 同阶段、在生物体对外界环境的压力的反应、在个 体的衰老与死亡等不同的环境下发育调控基因的表 达是不同的，这就是基因的差别表达（differential expression）。mRNA的差别显示技术就是用来分 离这些差别表达的基因的一项有用的技术。 该技术是P.Liang & A.D.Pardee 1992年建立的，全 称为mRNA差别显示PCR(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR)
原理:该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的 基因进行扩增。 3’端引物:利用mRNA的poyA尾巴设计。根据 mRNA结构分析知道, poly a尾巴之前的两个碱基 只有12种可能的排列组合: 5-AGAAAAA---AA-3 5- CGAAAAA-AA-3′ 5′- GGAAAAA-AA-3′ 5-TGAAAAA--AA-3 5′ AAAAAA-AA-3′ 5′- CTAAAAA→AA-3 5′- GTAAAAA A-3 5 TAAAAA-AA-3′ 5′- ACAAAAA--AA-3 5- CCAAAAA--AA-3′ 5′- GCAAAAA-AA-3 5′ TCAAAAA-AA-3
原理：该技术是利用两组特殊的引物对差别表达的 基因进行扩增。 3’端引物：利用mRNA的poly A尾巴设计。根据 mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基 只有12种可能的排列组合：
根据这12种排列组合,设计12种不同的引物,这样 就将所有mRNA分成了12组。这些引物由11-12个T 及两个其它的碱基组成,用通式5-T1MN或5 T2MN表示,M为A、G、C的任一种,N为A、G C、T的任一种。这种引物称锚定引物。 5端引物:5端为10个碱基(10-mer)组成的随机 引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某 些分子发生杂交,杂交位点也可能在mRNA的不同 位点上。 用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增,可 获得50~-100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻 找更多的DNA差异带,应使用全部的12种锚定引 物以及尽可能多的5°随机引物
根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，这样 就将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T 及两个其它的碱基组成，用通式5’-T11MN或5’- T12MN表示，M为A、G、C的任一种，N为A、G、 C、T的任一种。这种引物称锚定引物。 5’端引物：5’端为10个碱基（10-mer）组成的随机 引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一 些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA的不同 位点上。 用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增，可 获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻 找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引 物以及尽可能多的5’随机引物
(b) 一 NMAAAAAAAAAAAAA A(A NMrTTTTTTTTI, 反转录酶 3‘端锚定引物(5′-T,亻N-3′) NMAAAAAAAAAAAAAAA(A NMTTTTTTTTI 5端随机引物 NMTTTTTTTTTrT 3端锚定引物(s'T1MN-3) PCR 5°端随机引物 放射性标记 dNTPs - NMTTTTTTTTTTI B (d) 1A组特有的条带 2B组特有的条带 3A、B共有但丰度不同的条带